摘要：目的 探討參芎滴丸對MCAO大鼠EBA的影響。方法 線栓法制備MCAO模型，在MCAO造模前7d連續(xù)灌胃參芎滴丸預(yù)處理及在MCAO造模后連續(xù)灌胃參芎滴丸3d，觀察神經(jīng)缺損評分，免疫組化法檢測EBA的表達(dá)。結(jié)果 與MCAO組比較，參芎滴丸預(yù)處理可提高EBA的表達(dá)（P <0.05）；參芎滴丸MCAO后給藥對EBA 的表達(dá)有一定提高，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論 參芎滴丸可以減輕神經(jīng)缺損癥狀，可能與調(diào)高EBA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：參芎滴丸； MCAO；大鼠；EBA；研究

血腦屏障能夠調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的水運(yùn)輸、水代謝，并且參與限制血漿中溶質(zhì)分子進(jìn)人神經(jīng)系統(tǒng)、維持腦脊液生成、代謝等重要過程，以維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)需要有一個(gè)高度可控非常穩(wěn)定的微環(huán)境。Perdiki[1]等研究認(rèn)為EBA是血腦屏障屏障功能完整性的可靠指標(biāo)。在急性缺血性卒中常伴見血腦屏障損害，腦水腫出現(xiàn)，并加重缺血損害。參芎滴丸以益氣活血化瘀組方，以研究其對EBA的影響。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成7組: 正常組（6只）、假手術(shù)①組（6只）、MCAO①組（6只）、參芎滴丸預(yù)處理+MCAO組（6只）、假手術(shù)②組（6只）、MCAO②組（6只）、MCAO+參芎滴丸組（6只）。正常組不予處理，MCAO造模方法及假手術(shù)組處理見上文。其中：參芎滴丸預(yù)處理給藥研究分組：正常組、假手術(shù)①組、參芎滴丸預(yù)處理+MCAO組、MCAO①組。參芎滴丸預(yù)處理+MCAO組于MACO手術(shù)前1w灌胃給予參芎滴丸，正常組、假手術(shù)①組、MCAO①組以等量生理鹽水灌胃。術(shù)后24h動(dòng)物處死，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

參芎滴丸MCAO后給藥研究分組：正常組、假手術(shù)②組、MCAO②組、MCAO+參芎滴丸組。MCAO+參芎滴丸組于手術(shù)后開始灌胃給藥，正常組、假手術(shù)②組、MCAO②組以等量生理鹽水灌胃。術(shù)后72h處死動(dòng)物，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.2 藥品與試劑EBA、SC-7382（兔抗大鼠IgG）， SUNTA CRUZ公司；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，SP9000 Kit（鼠/兔）Lot724944A ，山羊超敏二步法 Kit PV9003 Lot K105920B ，顯色劑DAB（Kit ZL1-9032 Lot 457500A），均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型的制備參照zea Longa[2]等建立的大鼠大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線阻斷方法，具體步驟略。假手術(shù)組只進(jìn)行術(shù)前麻醉，血管分離術(shù)，暴露分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，不結(jié)扎及導(dǎo)入栓線。

1.4 入組標(biāo)準(zhǔn)參照Bederson[3]的方法，采用四級評分法(0~4分)，分?jǐn)?shù)越高，說明其神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。在參芎滴丸預(yù)處理給藥研究中，造模后神經(jīng)功能缺損評分≥1分即納入。在參芎滴丸MCAO后給藥研究中，1≤神經(jīng)功能缺損評分＜4即納入。

1.5 參芎滴丸實(shí)驗(yàn)中參芎滴丸灌胃劑量：10g（原生藥）/kg（臨床劑量的10倍）；灌胃時(shí)配成混懸液，每1ml混懸液含5.5g 原生藥。

1.6 EBA的檢測采用免疫組化方法，由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0.05為顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，方差齊以LSD統(tǒng)計(jì)，不齊以Games-Howell統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1參芎滴丸預(yù)處理給藥對MCAO大鼠神經(jīng)癥狀學(xué)的影響見表1，參芎滴丸預(yù)處理試驗(yàn)中：MCAO組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)缺損癥狀（2.37±0.26），與正常組、假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01）。參芎滴丸預(yù)處理能顯著改善大鼠腦梗死后24h的神經(jīng)損傷癥狀（2.00±0.14），與MCAO①組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。

注：NDS與正常組相比，*P<0.01; 與MCAO①相比，+P<0.05

2.2參芎滴丸MCAO后給藥對大鼠神經(jīng)癥狀學(xué)的影響見表2，參芎滴丸MCAO后給藥試驗(yàn)中：MCAO組大鼠亦出現(xiàn)明顯的神經(jīng)缺損癥狀（2.3±0.23），與正常組、假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。參芎滴丸治療3d能顯著改善動(dòng)物腦梗死后的神經(jīng)損傷癥狀（1.95±0.16），與MCAO組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

注：NDS與正常組相比，*P<0.01;與MCAO②相比，+P<0.05

2.3 參芎滴丸預(yù)處理對MCAO大鼠EBA影響由表3見大鼠腦缺血24h后組織中EBA表達(dá)顯著減少，MCAO①組(0.73±0.31)與正常組(20.88±5.93)相比，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；參芎滴丸預(yù)處理對于EBA的表達(dá)有提高作用，參芎滴丸預(yù)處理+MCAO組(5.82±2.81)與MCAO①組相比，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：與正常組相比，☉P>0.05；與正常組相比，* P<0.01；與MCAO①組相比，# P<0.05

2.4參芎滴丸MCAO后給藥對MCAO大鼠EBA影響見表4。由表4可見大鼠腦缺血72h后組織中EBA表達(dá)顯著減少，MCAO②組(0.98±1.40)與正常組(20.88±5.93)相比，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；參芎滴丸缺血后給藥對于EBA的表達(dá)有一定提高作用，但MCAO+參芎滴丸組(3.59±1.58)與MCAO②組相比，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

注：與正常組相比：☉P>0.05， * P<0.01；與MCAO②組：+ P>0.05。

2.5病理結(jié)果EBA（×400）見圖1~圖5。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中參芎滴丸預(yù)處理治療及MCAO后治療都可以改善MCAO大鼠神經(jīng)癥狀學(xué)評分，提示具有神經(jīng)保護(hù)作用。

EBA主要在具有血-腦屏障特性的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有特異性的表達(dá)，其免疫反應(yīng)性與血腦屏障的完整性相關(guān)，與血腦屏障的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等功能有聯(lián)系。

借助外源性示蹤劑和電鏡觀察，通過靜脈注射抗-EBA抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：內(nèi)皮細(xì)胞間連接變寬，胞漿囊泡和空泡增加；許多微血管周圍星形細(xì)胞足突腫脹；大分子示蹤劑在囊泡、空泡、變寬的旁細(xì)胞裂隙、血管周圍間隙和腦室中呈現(xiàn)?？梢奅BA與血腦屏障通透性有關(guān)，EBA抗原-抗體免疫反應(yīng)，引起EBA表達(dá)減少，內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接開放和跨內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)囊泡增多，可能是血腦屏障通透性增加的可能機(jī)制之一?？虏萚4]研究大鼠實(shí)驗(yàn)性腦創(chuàng)傷挫傷灶內(nèi)皮屏障抗原的動(dòng)態(tài)變化，傷后1dAQP4和EBA免疫反應(yīng)性明顯消失。劉式威等[5，6]研究提示EBA表達(dá)減少和血腦屏障通透性增加有關(guān)。

參芎滴丸是按5類新藥要求由從丹參、川芎、黃芪等中藥中提取的多種有效成分制成的制劑，已經(jīng)獲得發(fā)明專利（專利號碼：ZL200910262686），由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備，灌胃時(shí)配成懸濁液，工藝略。相關(guān)研究提示參芎滴丸通過抑制腦缺血白細(xì)胞粘附分子CD11/CDl8、ICAM-1mRNA、TNF-αmRNA、NF-κB、caspase3的表達(dá)，抑制MCAO模型大鼠腦梗死早期的炎性反應(yīng)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，有一定的量效關(guān)系[7~9]。

本實(shí)驗(yàn)中參芎滴丸預(yù)處理治療可以顯著上調(diào)EBA的表達(dá)，推測參芎滴丸可能通過調(diào)節(jié)AQP-4、EBA的表達(dá)，改善血腦屏障，減輕腦水腫，起到改善神經(jīng)缺損癥狀。

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編輯/王海靜