摘要：本文通過巢式RT-PCR方法檢測60例HCC患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)中MAGE-A1，A3mRNA表達(dá)，以30例健康志愿者外周血標(biāo)本作為對照組，進行MAGE-A1，A3mRNA和AFPmRNA對比檢測。結(jié)果顯示MAGE-A1，A3在HCC患者外周血中高表達(dá)，可聯(lián)合AFP作為特異性腫瘤標(biāo)記物用于肝癌患者的檢測。

關(guān)鍵詞：肝癌，黑色素瘤抗原基因；巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，早期發(fā)現(xiàn)與診斷是提高臨床治愈率的有效手段。本試驗采用巢式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法檢測編碼腫瘤相關(guān)抗原的黑色素瘤抗原(melanoma antigen，MAGE)MAGE-A1和MAGE-A3基因在HCC外周血中的表達(dá)，并對檢測結(jié)果的臨床意義進行了初步探討。

1資料與方法

1.1一般資料實驗組為2011年1月~2013年6月沈陽市第四人民醫(yī)院肝膽外科收治的HCC患者60例，伴有乙型肝炎病毒陽性46例。男女比例為2:3，年齡38~72歲，平均56.3歲?；颊呔惺中g(shù)完整切除病灶，并經(jīng)術(shù)后病理證實。30例健康志愿者外周血標(biāo)本作為對照組，男22例，女8例，年齡32~45歲，平均37.4歲。外周血標(biāo)本的采集 HCC癌患者外周血(10ml)在術(shù)前1d采集。對照組血標(biāo)本擇期采集。使用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC）。引物:根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中所查MAGE-A1，A3基因序列，使用Omiga2軟件設(shè)計引物。試劑:Trizol試劑購自美國Gibco公司，脫氧核苷酸（dNTPs)購自Pharmacia公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)和TaqDNA聚合酶購自Promega公司。

1.2方法

1.2.1總RNA提取 取1×107個PBMC加入Trizol試劑1ml裂解，經(jīng)三氯甲烷分層、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌干燥后，將所得RNA溶于無RNA酶的純水中，采用紫外分光光度計(Beckman公司.1DU 640)對其定量后再進行cDNA合成和RNA電泳。

1.2.2 cDNA合成 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為:MgCl2 4μL，10×Buffer2μL，dNTP2μL， Oligo(dT)1μL，RNasin0.5μL，AMV酶5μL，Template4μL，加無RNA酶的雙蒸水補足20μL。42℃孵育30 min，95℃滅活酶活性5min，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Nested RT-PCR反應(yīng)體系為:MgCl23μL，10×Buffer5μL，dNTP1μL，引物sense 1μL。引物antisense1μL。Taq聚合酶0.5μL，cDNA 5μL，加無RNA酶的雙蒸水補足50μL。以MAGE-A1，A3，AFPmRNA為靶基因時，PCR循環(huán)條件參照文獻[1，2]。終產(chǎn)物分別在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察DNA條帶，凝膠成像分析儀照相。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 10.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，使用χ2檢驗和四格表確切概率法。

2結(jié)果

2.1 MAGE-A1，A3mRNA在HCC患者外周血中的表達(dá)情況RT-PCR電泳顯示：所有內(nèi)參照均為陽性。健康者外周血中未檢測到MAGE-A1，A3mRNA的表達(dá)。60例HCC患者癌組織中MAGE-A1mRNA表達(dá)的陽性率為38.0%（23/60），MAGE-A3mRNA表達(dá)的陽性率為48.3%(29/60)，AFPmRNA表達(dá)的陽性率為73.3%(44/60)均高于癌旁組織（0%）(P<0.01)。

2.2MAGE-A1，A3mRNA和AFPmRNA在HCC患者外周血中聯(lián)合表達(dá)情況60例HCC中，至少表達(dá)1種MAGE基因的42例，表達(dá)率為70%；表達(dá)2種MAGE基因的19例，表達(dá)率為33%，58例HCC患者至少表達(dá)1種基因，表達(dá)率為96.7%。MAGE-A1mRNA/AFPmRNA陽性表達(dá)20例，表達(dá)率為33.3%。MAGE-A3mRNA/AFPmRNA陽性表達(dá)26例，表達(dá)率為43.3%。MAGE-A1，A3mRNA/AFPmRNA陽性表達(dá)16例，表達(dá)率為26.7%。

2.3MAGE mRNA表達(dá)與臨床有關(guān)指標(biāo)的關(guān)系60例HCC中MAGE-A1，A3mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、有無包膜以及乙型肝炎病毒感染等指標(biāo)無關(guān)(P>0.05)；與腫瘤大小及AFP水平存在相關(guān)性(P<0.05)

3討論

潛伏腫瘤細(xì)胞(OTC)是與患者預(yù)后有關(guān)的危險因素。肝癌患者外周血OTC的檢測己經(jīng)成為研究的熱點。

本研究顯示，60例HCC患者癌外周血中MAGE-A1，A3mRNA均有較高表達(dá)，70%至少表達(dá)1種MAGE基因。聯(lián)合AFP檢測后，96.7%的HCC患者至少表達(dá)1種基因，高于單一檢測AFP的表達(dá)率（73%）。對比臨床資料發(fā)現(xiàn)MAGE-A1，A3mRNA的表達(dá)與腫瘤大小及AFP水平均存在相關(guān)性，提示檢測血清中MAGE-A1，A3基因的表達(dá)，可能作為HCC的輔助診斷指標(biāo)之一。

對比國外的相關(guān)研究資料其MAGE-A1，A3mRNA表達(dá)率均明顯高于本研究，這些差異與樣品量的不同或患者的選擇和地區(qū)的差異有關(guān)。國外報道的病例多為丙型肝炎病毒陽性。

綜上，提示我們可以以MAGE-A1，A3基因作為HCC患者特異性腫瘤標(biāo)記物，為HCC患者的診斷和治療提供幫助。

參考文獻：

[1]Kufer P，Zippelius A，Lutterbuse R，et al.Heterogeneous expression of MAGE-A genes in occult disseminatedtumor cells a novel multimarker reverse transcription-polymerase chain reaction for diagnosis of micrometastatic disease[J]．Cancer Res，2002，62，251-261.

[2]Komeda T，F(xiàn)ukuda Y，Sando T，et al.Sensitivedetectionof circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood[J]．Cancer，1995，75，2214-2219.

編輯/許言