摘要：目的 建立過表達(dá)CCR3人SGC7901胃癌細(xì)胞細(xì)胞株，為后續(xù)CCR3在胃癌轉(zhuǎn)移的研究奠定基礎(chǔ)。方法 分離正常人外周血單個核細(xì)胞，提取總RNA，PCR擴增CCR3基因CDS序列，連接至質(zhì)粒pEFP-N1，進(jìn)行CCR3基因的克隆，構(gòu)建含有CCR3基因的pEFP-N1-CCR3重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對人SGC7901胃癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。結(jié)果 Realtime-PCR及Westernblot證實CCR3基因能夠在人SGC7901胃癌細(xì)胞中正確表達(dá)。結(jié)論 成功建立穩(wěn)定表達(dá)CCR3基因的SGC7901胃癌細(xì)胞株，為研究CCR3在胃癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移中的機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：CCR3；SGC7901細(xì)胞；胃癌轉(zhuǎn)移

趨化因子受體（Chemokine receptor）是表達(dá)在一些特定的細(xì)胞表面的G蛋白偶連的七跨膜域受體[1]。這些受體與細(xì)胞外的配體趨化因子結(jié)合。與特異的趨化因子結(jié)合后，趨化因子受體引發(fā)鈣離子內(nèi)流而產(chǎn)生細(xì)胞趨化反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞到生物體的特定部位。CCR3在胃癌遠(yuǎn)端遷移上到底扮演什么樣的角色也未完全清楚。目前， 將外源性CCR3基因轉(zhuǎn)入人胃癌細(xì)胞使其過度表達(dá)未見報道。本實驗嘗試構(gòu)建含有CCR3的重組質(zhì)粒pEFP-N1-CCR3并轉(zhuǎn)染至人SGC7901胃癌細(xì)胞，并檢測轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞CCR3的表達(dá)情況。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1質(zhì)粒菌株和慢病毒包裝細(xì)胞pEFP-N1慢病毒穿梭載體，psPAX2和pMD2G包裝質(zhì)粒，大腸桿菌DH5。人SGC7901胃癌細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清。

1.1.2 主要試劑及引物 Lipofectine2000轉(zhuǎn)染試劑盒；T4連接酶；質(zhì)粒抽提試劑盒；限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI；胎牛血清；CCR3一抗；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG。

1.2人SGC7901胃癌細(xì)胞的培養(yǎng) 人SGC7901胃癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖的完全培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2孵育箱中貼壁培養(yǎng)，0.25%胰酶3d傳代換液一次。

1.3 pEFP-N1-CCR3的構(gòu)建及鑒定

1.3.1 CCR3的CDS序列擴增 取健康人外周血，淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞并抽提總總RNA，在Pubmed中的nucleotide上查詢CCR3的CDS編碼區(qū)并設(shè)計克隆引物， 并在克隆引物中加入BglII和EcoRI酶切位點， 用taq聚合酶擴增CCR3的CDS序列，

1.3.2 重組載體構(gòu)建和鑒定 將PCR反應(yīng)電泳回收產(chǎn)物和pEFP-N1質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI 37℃雙酶切1h。取5uL酶切好的PCR片段與5uL酶切好的質(zhì)粒DNA反應(yīng)液混合并加入T4連接酶及其連接酶緩沖液， 4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物加入DH5感受態(tài)細(xì)胞， 將轉(zhuǎn)化的DH5感受態(tài)細(xì)胞涂抹到含100μg/ml Kana 抗性的LB固體培養(yǎng)基上，放置室溫至液體吸收，并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆菌落并加入含100μg/ml Kana 抗性的LB液體培養(yǎng)基上搖菌過夜， 抽提LB液體培養(yǎng)基中的重組質(zhì)粒，并用BglII和EcoRI限制性內(nèi)切酶雙酶切后行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 陽性菌落送上海生工生物公司進(jìn)行測序分析，以鑒定pEFP-N1-CCR3質(zhì)粒中是否正確插入CCR3的CDS片段。

1.4轉(zhuǎn)染CCR3的SGC7901細(xì)胞中CCR3表達(dá)的檢測

1.4.1 Real-Time PCR檢測CCR3mRNA表達(dá) 根據(jù)GenBank的人CCR3基因序列， 設(shè)計熒光定量PCR引物并合成。上游引物序列：5′TGGCATGTGTAAGCTCCTCTC 3′，下游引物序列：5′ CCTGTCGATTGTCAGCAGGATTA 3′，設(shè)計并合成內(nèi)參照β-actin引物， 上游引物序列：5′CTCCATCCTGGCCTCGCTGT3′，下游引物序列：5′GCTGTCACCTTCACCGTTCC 3′。在lipofection瞬時轉(zhuǎn)染4d后提取細(xì)胞總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行real-time PCR。反應(yīng)條件：95℃維持10min； 95℃ 15 s、60℃ 50 s；共35個循環(huán)。各組mRNA同內(nèi)參基因相比得到相對表達(dá)量。

1.4.2 Western blotting檢測CCR3蛋白表達(dá) lipofection轉(zhuǎn)染4d后，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白。用蛋白濃度測定試劑盒調(diào)整各組蛋白濃度后并加入蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min再進(jìn)行PAGE蛋白電泳。將轉(zhuǎn)移蛋白的PVDF膜用脫脂奶粉封閉0.5h，分別加入CCR3和β-actin一抗4℃孵育過夜。次日用1×TBST洗膜3次，5min/次，充分洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗，室溫孵育0.5h，用1×TBST洗膜3次，最后加入定影液和顯影液，在Bio-Rad成像儀上顯影。

2 結(jié)果

2.1 CCR3基因的提取與鑒定 根據(jù)GenBank的CCR3基因編碼區(qū)（CDS）設(shè)計相應(yīng)引物， PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，可見1067bp的特異條帶， 與GenBank一致。

2.2 重組pEFP-N1-CCR3質(zhì)粒的篩選和鑒定 挑取LB固體培養(yǎng)基陽性克隆菌搖菌并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與GenBank中CCR3基因序列比對完全正確，無任何堿基突變。

2.3 Real Time PCR檢測mRNA結(jié)果 CCR3-人SGC7901胃癌細(xì)胞組CCR3mRNA表達(dá)量明顯高于GFP-人SGC7901胃癌細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0084）。

2.4 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 兩組均在約55kDa（CCR3）、42kDa （β-actin）處見到特異性條帶，發(fā)現(xiàn) CCR3-SGC7901組條帶顏色相比GFP-SGC7901組顏色明顯較深（圖6）。經(jīng)過分析，顯示CCR3-SGC7901組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中CCR3蛋白表達(dá)量明顯升高，表明CCR3可以正確在SGC7901細(xì)胞中表達(dá)。

3 討論

通過慢病毒pEFP-N1穿梭載體， 將CCR3和GFP基因融合表達(dá)在一起， 這將有利于轉(zhuǎn)染后對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行示蹤研究，達(dá)到GFP和CCR3的融合表達(dá)。為了驗證所構(gòu)建重組質(zhì)粒pEFP-N1-CCR3的活性，本實驗成功構(gòu)建了人CCR3和GFP基因融合表達(dá)的重組質(zhì)粒pEFP-N1-CCR3， 具有良好的表達(dá)活性，并且能夠在人SGC7901胃癌細(xì)胞正確表達(dá)。

編輯/王海靜