摘 要 “減數(shù)分裂期染色體制備實(shí)驗(yàn)”是動(dòng)物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課程重要內(nèi)容。本文介紹了小鼠睪丸細(xì)胞減數(shù)分裂染色體標(biāo)本制作的改進(jìn)方法，通過本方法可制備和觀察到大量分散良好、背景清晰、染色體結(jié)構(gòu)緊湊的睪丸細(xì)胞減數(shù)分裂各期分裂相，得到較好的實(shí)驗(yàn)效果。

關(guān)鍵詞 動(dòng)物遺傳學(xué) 睪丸細(xì)胞 減數(shù)分裂 染色體 改進(jìn)

中圖分類號(hào)：G424 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Animal Genetics Teaching Experiment \"Mouse Testis Meiotic

Chromosome Specimen\" Methods Improvement

ZHANG Yanjun， LAI Shuangying， SU Rui， ZHANG Wenguang

（College of Animal Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010018）

Abstract \"Preparation of meiotic chromosomes experiment\" is an important part of animal genetics experiment course. This article describes the mouse testis meiotic chromosome specimen of the improved method， can be prepared by this method and observed a large number of well-dispersed， clear background， compact testicular meiotic chromosome structure of each phase of the division， get better experimental results.

Key words animal genetics； testicular cells； meiosis； chromosome； improvement

遺傳學(xué)既是一門歷史悠久的學(xué)科，又是一門發(fā)展迅速、實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科，研究范圍正在不斷拓寬和深化，新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn)。動(dòng)物遺傳學(xué)作為遺傳學(xué)的一個(gè)分支，是畜牧獸醫(yī)學(xué)科的基礎(chǔ)課程。動(dòng)物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課是配合動(dòng)物遺傳學(xué)理論教學(xué)而設(shè)置的，通過實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)，力求使同學(xué)們能夠?qū)?dòng)物遺傳學(xué)的基本理論和概念有更加深刻的認(rèn)識(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中培養(yǎng)同學(xué)們觀察問題、分析問題和解決問題的能力，同時(shí)也鍛煉了學(xué)生的實(shí)際操作能力。

減數(shù)分裂是等位基因的分離和非等位基因的自由組合的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。在教學(xué)中，要讓學(xué)生理解和掌握細(xì)胞的減數(shù)分裂，就必須借助較好的實(shí)驗(yàn)課，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的效果將直接影響學(xué)生對(duì)理論基礎(chǔ)的理解和掌握。“細(xì)胞減數(shù)分裂期染色體制備實(shí)驗(yàn)”是動(dòng)物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課程重要內(nèi)容，一些遺傳學(xué)教學(xué)人員在該實(shí)驗(yàn)方法上進(jìn)行了一些摸索，也取得了一定的效果。①②③④⑤近年來，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“家畜遺傳繁育系列課程國家教學(xué)團(tuán)隊(duì)”動(dòng)物遺傳學(xué)課程教學(xué)人員結(jié)合動(dòng)物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)和其他研究人員的研究成果，對(duì)小鼠睪丸組織細(xì)胞減數(shù)分裂期染色體標(biāo)本制作實(shí)驗(yàn)方法的進(jìn)行了摸索、改進(jìn)，建立了一種有效的制備方法，可清晰地觀察到減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期細(xì)胞核與染色質(zhì)的變化，獲得較理想的效果。下面對(duì)該實(shí)驗(yàn)的操作過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果介紹如下，供遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)人員參考。

1 材料和方法

1.1 材料

性成熟的雄性小鼠。

秋水仙素水溶液（1mg/ml），0.45%檸檬酸鈉溶液，5% 8-羥基喹啉，0.075M KCL溶液。

固定液：甲醇、氯仿、冰醋酸6：3：1比例混合，卡諾固定液：甲醇、冰醋酸以3：1混合，Giemsa染液。

1.2 方法

（1）摘出睪丸：選取健康的，性成熟的雄性小鼠，于腹腔內(nèi)注射秋水仙素（約3 g/g體重）。注射之后2h左右，將鼠引頸處死，腹面向上放在紙上，用70%酒精棉球從下腹部開始，向上將體毛分開。用手術(shù)剪剪開腹部皮，然后用兩只鑷子剝離皮膚，取出睪丸。在玻璃平皿中加入4ml 0.45%檸檬酸鈉與0.075MKCL溶液1：1混合液中，再加入0.15ml秋水仙素。將睪丸移入平皿。

（2）取精細(xì)管：剔除脂肪后，迅速剝開睪丸被膜，然后將精細(xì)管稍加洗滌，放于另一事先準(zhǔn)備好的有5ml 0.45%檸檬酸鈉與0.075MKCL溶液1：1混合液的玻璃平皿中。用剪刀迅速將精細(xì)管剪成小段，剪得愈細(xì)碎愈好，然后一邊攪動(dòng)一邊輕壓材料，使精細(xì)管內(nèi)的細(xì)胞游離于液體中。將混合液移入離心管中，以800rpm 離心5min，棄去上清液。

（3）低滲處理：補(bǔ)加低滲液至5ml， 37℃低滲處理30分鐘。

（4）細(xì)胞固定：在上述低滲液中，加入幾滴5% 8-羥基喹啉進(jìn)行整體固定，以800rpm 離心5min，棄去上清液。加入固定液（甲醇：氯仿：冰醋酸為6：3：1）處理20分鐘。900rpm離心10min， 棄上清。加入新配制的卡諾固定液重復(fù)固定1次。

（5）分散細(xì)胞：吸棄上清液，加入5ml的60%乙酸，輕輕搖動(dòng)2分鐘（使細(xì)精管上的細(xì)胞游離下來，以便得到細(xì)胞懸液），300rpm，離心5min。取上液移入另一5ml離心管內(nèi)，1000rpm離心10min，棄上清液。

（6）滴片：在沉淀物上加0.5ml的固定液制備細(xì)胞懸液，適當(dāng)高度滴在已用冰水預(yù)冷的清潔載玻片上，吹干或用微火烤干。

（7）染色：用Giemsa原液與9份磷酸緩沖液染色20分鐘，用流水沖洗，晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。

（8）觀察：將制備好的標(biāo)本可以直接進(jìn)行觀察，亦可加上蓋玻片封固后進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

通過本方法觀察可見大量分散良好、染色體結(jié)構(gòu)緊湊、背景清晰的小鼠睪丸生殖細(xì)胞減數(shù)分裂期分裂相。在制作過程中，曲細(xì)精管切碎后，在曲細(xì)精管周圍有流出大量不同分化期的細(xì)胞和液體（圖1-1）。低滲處理細(xì)胞后，細(xì)胞變大（圖1-2）。分裂間期細(xì)胞核核膜完整，核仁清晰可見（圖1-3）。前期I核仁消失，核膜開始在不同部位破裂（圖1-4）。細(xì)線期染色質(zhì)絲凝縮成細(xì)長的纖維樣染色體，但兩條姊妹染色單體的臂并未分離，在光學(xué)顯微鏡下看到很細(xì)的單線狀染色體結(jié)構(gòu)（圖1-5）。偶線期每對(duì)同源染色體開始聯(lián)會(huì)，能夠看到并行的兩條染色質(zhì)細(xì)線（圖1-6）。粗線期同源染色體完全聯(lián)會(huì)，形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體，染色體縮短變粗（圖1-7）。雙線期染色體進(jìn)一步縮短變粗，聯(lián)會(huì)復(fù)合體解體，同源染色體相互排斥而分離，染色體變得更加粗短（圖1-8）。終變期染色體高度濃縮，形成短棒狀結(jié)構(gòu)，兩條同源染色體仍由著絲粒連接（圖1-9）。中期I所有的二價(jià)體都排列在赤道板上，呈線狀分布（圖1-10）；從切面看去，染色體較分散，染色體更短更粗，適于觀察染色體的形態(tài)和數(shù)目（圖1-11）。后期I由于紡錘絲的收縮，雙價(jià)體中的兩條同源染色體向兩極移動(dòng)（圖1-12）。

圖1 小鼠睪丸細(xì)胞減數(shù)分裂各期染色體變化（10 X100）

3 討論

減數(shù)分裂是二倍體生殖細(xì)胞在形成配子時(shí)的一種特殊的細(xì)胞分裂，研究減數(shù)分裂無論在細(xì)胞遺傳學(xué)的理論或應(yīng)用上都具有十分重要的意義。Ford和Hamerton 運(yùn)用擠壓法首次成功地獲得了人類攀丸染色體的優(yōu)良標(biāo)本，從而結(jié)束了長期以來一直停滯不前的局面；Evans等采用氣干法制備哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂標(biāo)本，標(biāo)本質(zhì)量也有所提高，但仍然存在著一些不足之處。⑥

一般利用常規(guī)小鼠睪丸生殖細(xì)胞減數(shù)分裂標(biāo)本制片方法得到的分裂相較少且圖像也不太理想，觀察效果較差。

本教學(xué)團(tuán)隊(duì)動(dòng)物遺傳學(xué)教學(xué)人員在總結(jié)過去方法的基礎(chǔ)上對(duì)減數(shù)分裂標(biāo)本制備方法加以改進(jìn)，得到較好的實(shí)驗(yàn)效果。改進(jìn)法操作過程中在剝離曲細(xì)精管時(shí)，將睪丸放在含有秋水仙素的低滲液中，增加作用時(shí)間，可以降低細(xì)胞質(zhì)的粘稠度，得到效果好的分裂相。一般來說，制備純細(xì)胞懸液時(shí)，應(yīng)選擇滲透效果好，對(duì)染色體結(jié)構(gòu)影響較小的0.075 mol/ L氯化鉀溶液；而制備的細(xì)胞包含在組織中的則應(yīng)選用1%枸櫞酸鈉溶液。⑦本方法采用了0.45%檸檬酸鈉與0.075MKCL溶液1：1混合液作為低滲液，在低滲液中的操作， 應(yīng)注意動(dòng)作盡量輕柔，以減少細(xì)胞過早地破裂。在固定時(shí)，額外加入了5% 8-羥基喹啉進(jìn)行整體固定，然后進(jìn)行常規(guī)固定。一些研究人員在制作過程采取研磨曲細(xì)精管獲取各分裂期的細(xì)胞，⑧但研磨速度和用力一定要適度，速度太快或用力過大， 細(xì)胞易破裂；用力不足或速度太慢，不能將細(xì)胞從曲精細(xì)管中壓出來。本方法利用醋酸溶液使組織軟化的特點(diǎn)，用60%冰醋酸溶液軟化細(xì)精小管，在輕輕搖動(dòng)使生殖細(xì)胞散出。也能較好保護(hù)裂相細(xì)胞不破碎，從而提高鏡下分裂相細(xì)胞的檢出率。應(yīng)用本方法可以較好獲得雄性小鼠各階段的生殖細(xì)胞染色體，滿足教學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求。

注釋

① 蘇愛，劉金成，王振華，等.小鼠睪丸生殖細(xì)胞減數(shù)分裂標(biāo)本制作方法的改進(jìn)[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006.42（4）：366-368.

② 陳曉東，吳玲.小鼠雄性生殖細(xì)胞染色體制備方法的改進(jìn)[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001.17（3）：228-228.

③ 王彬，孫曉玲，劉麗波.雄性小鼠生殖細(xì)胞染色體制備方法的研究[J].中國公共衛(wèi)生，2004.20（3）：259.

④ 王嵐，劉麗莎，姬可平，等.動(dòng)物細(xì)胞染色體實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)和優(yōu)化[J].中國民族民間醫(yī)藥，2008（2）：7-8.

⑤ 李襲麗，白成江，許爾怡.小鼠睪丸生殖細(xì)胞染色體分析最佳實(shí)驗(yàn)條件的探討[J].癌變·畸變·突變，1989.1（1）：51-53.

⑥ 虞世嘉.小鼠辜丸細(xì)胞體外培養(yǎng)制備染色體的初步探討[J].解剖學(xué)通報(bào)，1984.7（1）：36-38.

⑦ 劉英芹，孫廣臣，劉英杰，等.60%醋酸溶液在小鼠減數(shù)分裂標(biāo)本制作中的應(yīng)用[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2002.25（3）：13.

⑧ 王慧陽.小白鼠細(xì)胞減數(shù)分裂玻片的制備[J].晉中師專學(xué)報(bào)，1997（l）：36.