摘要：目的 評(píng)價(jià)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)半乳甘露聚糖（GM）抗原在侵襲性曲霉菌（IA）早期感染診斷和療效監(jiān)測(cè)中的臨床價(jià)值。方法 以62例呼吸內(nèi)科、重癥醫(yī)學(xué)科及血液內(nèi)科造血干細(xì)胞移植（HSCT）患者為研究對(duì)象，針對(duì)患者連續(xù)檢測(cè)，共檢測(cè)標(biāo)本188份。采用ELISA法測(cè)定患者血清中GM含量，測(cè)定濃度可達(dá)0.5ng/ml。同時(shí)對(duì)所選病例進(jìn)行G實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和真菌培養(yǎng)，所得結(jié)果與GM結(jié)果聯(lián)合分析。結(jié)果 以1.0為陽(yáng)性界值，GM檢測(cè)的敏感性為53.8%，特異性100%，診斷符合率88.7%；以0.5為陽(yáng)性界值，敏感性為84.6%，特異性96.7%，診斷符合率95.2%。G實(shí)驗(yàn)顯示以GM0.5為陽(yáng)性界值GM陽(yáng)性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（68.58±12.76）pg/ml，GM陰性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（3.18±1.25）pg/ml，兩組數(shù)據(jù)經(jīng)t-檢驗(yàn)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。GM檢測(cè)可早于真菌培養(yǎng)方法9d預(yù)測(cè)曲霉感染。曲霉菌感染患者GM的連續(xù)監(jiān)測(cè)顯示抗曲霉菌治療前GM水平保持在較高水平，抗真菌治療有效患者的GM含量呈下降趨勢(shì)，無(wú)效死亡患者仍保持較高水平。結(jié)論 血清GM檢測(cè)是侵襲性曲霉菌早期感染診斷和療效監(jiān)測(cè)的有用指標(biāo)，與G實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用判斷效果更好。

關(guān)鍵詞：半乳甘露聚糖；曲霉菌；早期感染

近年來(lái)侵襲性曲霉菌感染（IA）發(fā)病率逐漸增多，已經(jīng)成為免疫功能低下患者致死率高的主要原因。有報(bào)道稱在造血干細(xì)胞移植（HSCT）患者中IA的發(fā)病率為2%～26%，實(shí)體器官移植患者中的發(fā)病率為1%～15%，死亡率可達(dá)到74%～92%。在中性粒細(xì)胞減少的患者（抗腫瘤治療后）和使用免疫抑制劑（干細(xì)胞移植、器官移植特別是骨髓抑制）或皮質(zhì)類固醇的患者，患者一旦發(fā)生曲霉菌感染，死亡率高達(dá)50%～90%。研究開(kāi)發(fā)早期、快速、準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)疾病的預(yù)后具有決定性的意義。半乳甘露聚糖（GM）是曲霉菌絲壁上的熱穩(wěn)定多糖抗原，有一個(gè)非免疫原性甘露聚糖核心和含半乳呋喃糖基的免疫反應(yīng)性側(cè)鏈。其半乳糖殘基具有抗原性，目前檢測(cè)該成分快速診斷曲霉菌病受到廣泛關(guān)注，被稱為最有前景的檢測(cè)曲霉菌感染的血清學(xué)方法。

1資料與方法

1.1一般資料 取自2012年1月～12月皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科、重癥醫(yī)學(xué)科、血液內(nèi)科住院患者送檢的血液、肺泡灌洗液等標(biāo)本62例。實(shí)驗(yàn)組32例，其中男20例，女12例，入選實(shí)驗(yàn)組均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)熱（T>37.5℃），經(jīng)廣譜抗生素治療4d后無(wú)效；長(zhǎng)期中性粒細(xì)胞減少；胸部影像學(xué)檢查出現(xiàn)新發(fā)病灶或出現(xiàn)肺部感染癥狀。對(duì)照組30例，其中男19例，女11例，為相應(yīng)科室同時(shí)期住院患者，均無(wú)深部真菌感染臨床癥狀。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) IA分3類：第1類確診IA，第2類高度懷疑IA（也稱臨床診斷），第3類可疑IA，診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合歐洲癌癥治療組織真菌病研究組（EORTC/MSG）制訂的IA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.3樣本采集 患者每3～4d用真空采血管采靜脈血3ml，采血后48h內(nèi)完成檢測(cè)。連續(xù)檢測(cè)GM抗原直到治療后癥狀和體征好轉(zhuǎn)、體溫下降至正常后2w，或患者死亡，或排除IA診斷為止。32例實(shí)驗(yàn)組共檢測(cè)血清樣本128份，30例對(duì)照組檢測(cè)樣本60份。所有患者還同時(shí)進(jìn)行影像學(xué)檢查，痰或血的病原菌培養(yǎng)，部分患者收集支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行培養(yǎng)及肺活檢進(jìn)行組織培養(yǎng)或病理學(xué)檢查。

1.4 GM檢測(cè)方法 法國(guó)BIO-RAD公司的曲霉菌酶免檢測(cè)試劑盒（PlateliaTM Aspergillus EIA）簡(jiǎn)述如下：分別加300μl被測(cè)血清或（質(zhì)控物）到每個(gè)1.5ml聚丙烯試管，每個(gè)試管加100μl血清處理液，用力混合或震蕩以徹底混勻試管，100℃水浴3min，10000g離心10min，上清液用來(lái)檢測(cè)GM抗原。每個(gè)孔中加50μl酶結(jié)合物，然后加50μl處理過(guò)的血清標(biāo)本上清液或質(zhì)控物，封板37℃干燥孵育90min，洗滌5遍，每孔迅速加200μl底物顯色劑，避光室溫下孵育30min，每孔中加入100μl終止液，波長(zhǎng)為450nm下測(cè)試每孔的吸光度（A值）。每次實(shí)驗(yàn)cut-off值均值必須在0.3～0.8之間，陽(yáng)性對(duì)照/cut-off值均值大于2，陰性對(duì)照值/cut-off值均值小于0.4作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)質(zhì)控。2次連續(xù)采集樣本均為陽(yáng)性或者同一份標(biāo)本連續(xù)兩次檢測(cè)均為陽(yáng)性才能判斷該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為曲霉菌感染陽(yáng)性。將IA剛開(kāi)始治療時(shí)所測(cè)得的GM光密度與含1ngGM標(biāo)準(zhǔn)品所測(cè)得的光密度的比值（GM指數(shù)GMI）作為基礎(chǔ)值。在第7d治療結(jié)束時(shí)采血樣測(cè)得的GMI與基礎(chǔ)GMI相比較，當(dāng)增加1.0時(shí)，被認(rèn)為治療失敗。在第14d治療結(jié)束時(shí)采血樣測(cè)得的GMI與基礎(chǔ)GMI相比較，當(dāng)增加1.0，被認(rèn)為治療失敗。

1.5 G實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法 真空采血管取靜脈血3ml后，混勻，3000r/min離心1min得富含血小板血漿，分離出血漿在10min內(nèi)使用，取上述富含血小板血漿0.1ml加入裝有0.9ml樣品處理液中輕輕混勻后，70℃保溫10min，取出后立刻放入冷水浴中3min冷卻至30℃以下，即為待測(cè)血漿樣品，取待測(cè)血漿樣品0.2ml加入反應(yīng)主劑中，輕輕混勻20s待完全溶解后用微量加樣器轉(zhuǎn)移至10×65mm無(wú)熱原平底反應(yīng)管中，立刻插入MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)計(jì)算含量。

2結(jié)果

2.1不同界值時(shí)血清GM的結(jié)果及敏感性和特異性 患者血清的GM值計(jì)算公式為 被檢血清A 值/cut-off均值A(chǔ)值。如果以GM值1.0為陽(yáng)性界值判斷標(biāo)準(zhǔn)，0.8

2.2 GM實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性與G實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以GM值0.5為陽(yáng)性界值，GM陽(yáng)性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（68.58±12.76）pg/ml，GM陰性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（3.18±1.25）pg/ml，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3連續(xù)監(jiān)測(cè)GM值與療效的關(guān)系 GM檢測(cè)同時(shí)對(duì)患者進(jìn)行標(biāo)本接種培養(yǎng)，結(jié)果顯示GM檢測(cè)陽(yáng)性可早于真菌培養(yǎng)方法9天預(yù)測(cè)曲霉感染，且對(duì)13例GM陽(yáng)性患者進(jìn)行抗曲霉菌治療，9例有效，4例無(wú)效死亡。每3～4d采集患者靜脈血進(jìn)行GM值測(cè)定，連續(xù)14d，發(fā)現(xiàn)4例治療無(wú)效死亡患者的血清GM值居高不下或進(jìn)行性升高，9例治療有效患者的血清GM值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

3討論

侵襲性真菌感染是指侵襲性深部組織和內(nèi)部以及全身的真菌感染，包括深部組織感染和真菌血癥。近20年來(lái)，由于大劑量廣譜抗生素、抗腫瘤藥物及免疫抑制劑的長(zhǎng)期應(yīng)用，各種導(dǎo)管在體內(nèi)的介入以及惡性腫瘤艾滋病等免疫功能低下患者的不斷增加。侵襲性真菌感染的發(fā)病率明顯上升，在醫(yī)院感染中占有重要地位，日益成為患者死亡的重要原因之一[5]。侵襲性真菌感染臨床診斷比較困難，臨床表現(xiàn)可因感染部位不同、臨床癥狀體征不具有特異性，而不易與細(xì)菌感染相區(qū)別。目前GM診斷IA還存在著患者因素、實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)本因素等問(wèn)題，因此需要針對(duì)不同科室的患者群以及標(biāo)本類型等統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)條件，選取合適的OD值及陽(yáng)性界值，使各實(shí)驗(yàn)室之間具有可比性。該實(shí)驗(yàn)選取了呼吸內(nèi)科、重癥醫(yī)學(xué)科、血液內(nèi)科的標(biāo)本，但未詳細(xì)區(qū)分標(biāo)本類型是血液還是肺泡灌洗液，且收集標(biāo)本量較少，這在今后的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需加以改進(jìn)和豐富標(biāo)本量?？傊?，GM檢測(cè)IA具有早期、快速、敏感性高、特異性高、診斷符合率高等特點(diǎn)，有待于在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛開(kāi)展，在臨床診斷IA時(shí)需綜合臨床癥狀體征及其他診斷措施，達(dá)到早期診斷、早期治療、降低病死率目的。

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編輯/申磊