摘要[目的] 對6個金銀花主要栽培品種的POD同工酶進行研究,以揭示金銀花POD同工酶的變化規(guī)律。[方法]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對6個金銀花主要栽培品種的過氧化物酶(POD)同工酶譜進行分析。[結(jié)果]它們的POD酶譜條帶數(shù)在4~18,其中大毛花的酶譜帶數(shù)最多,達18條,紅腺忍冬最少,為4條,a2和b6可以作為這6種金銀花栽培品種共有的固有酶帶。九豐一號(3年)與大毛花的相似度指數(shù)較高(62.4),說明它們之間的親緣關(guān)系相對較近;其次是山銀花和盤葉忍冬(57.4),再次是九豐一號和紅腺忍冬(49.3)。九豐一號(3年)和紅腺忍冬的相似度指數(shù)最低(6.4),反映它們之間的親緣關(guān)系很遠。[結(jié)論] 為金銀花品種育種與鑒定提供科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞 金銀花;過氧化物酶同工酶;品種鑒定;親緣關(guān)系
中圖分類號S188文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611(2014)29-10091-03
作者簡介丁銳(1977- ),男,陜西漢中人,講師,從事資源生物開發(fā)利用研究。
金銀花(Flos lonicerae)又名金銀藤、鴛鴦藤或雙花,為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物忍冬(Lonicera japonica thunb)及同屬多種植物的干燥花蕾,是一種“藥食同源”的綠色植物,其味甘性寒,具有清熱解毒功能,是臨床常用的中藥之一[1-2]。在我國,金銀花主要分布在河南(南銀花)、山東(東銀花、濟銀花)、廣西(山銀花)、湖南、廣東、湖北、安徽、四川、浙江、陜西、江蘇、江西、貴州等地[3] 。
同工酶是基因的直接表達者。隨著對同工酶結(jié)構(gòu)功能、基因表達、染色體基因定位等研究的深入,同工酶技術(shù)被成功應(yīng)用于鑒定各類植物種質(zhì)資源的地理起源、分類等。近年來在真菌菌種的鑒定工作中也得到了應(yīng)用[4] 。其中,POD同工酶的研究利用較廣泛[4-10]。
由于金銀花在我國各地區(qū)都有廣泛種植,且其品種多樣,因此,金銀花的育種工作者往往需要引進各個地區(qū)的優(yōu)良品種以培育出更加優(yōu)良的品種。在引種過程中,對金銀花品種的鑒別極其重要,因為部分性狀較差的品種與某些優(yōu)良品種具有形態(tài)學(xué)上的相似性,難以直接區(qū)分。不法人員則趁機以次充好,以假冒偽劣商品出售,破壞了金銀花市場秩序。筆者旨在對6個金銀花主要栽培品種的POD同工酶進行研究,以揭示金銀花POD同工酶的變化規(guī)律,為金銀花品種育種與鑒定提供科學(xué)依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料紅腺忍冬(四川)、山銀花(漢中)、九豐一號(山東)、盤葉忍冬(湖南)、雞爪花、大毛花(山東)。這6個金銀花品種均從陜西省漢中市南鄭陽春藥業(yè)公司金銀花種植基地采集。
1.2儀器高壓雙穩(wěn)電泳儀(DYYⅢ4型,北京六一儀器廠),垂直電泳槽(DYYⅡ28型,櫚樣品梳 24齒,北京六一儀器廠),LGR16W 高速微量冷凍離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。
1.3方法每個品種取幼葉約200 mg,在冰浴中制樣。提取緩沖液由1 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCl、1 mmol/L 抗壞血酸、16.7% 蔗糖、14 mmol/L 巰基乙醇、0.1 mmol/L TrisHCl(pH7.8)組成。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,凝膠濃度10%。醋酸-聯(lián)苯胺染色。
電泳后的凝膠,利用美國BIORAD 凝膠成像系統(tǒng),對試驗結(jié)果進行處理,應(yīng)用Quantity One4.1.0 軟件,選擇DICE 相似性系數(shù)、Neighbor Joining 進行聚類分析得聚類圖。
2結(jié)果與分析
2.1金銀花的過氧化物酶同工酶譜分析根據(jù)圖1~2酶帶的特點和遷移率的不同,將酶帶由負極到正極分為a、b、c 3個區(qū),各區(qū)酶帶分別標(biāo)為a1~a3、b1~b16、c1~c8,遷移率分別為0.011~0.062、0.130~0.388、0.412~0.818。6個品種的酶帶總數(shù)為 27條,各栽培品種酶帶數(shù)為4~ 18 條,帶位也有差異:大毛花的酶帶數(shù)最多(18條),紅腺忍冬的酶帶數(shù)最少(4條);酶帶都較穩(wěn)定,表現(xiàn)出相似的遺傳基礎(chǔ),但各品種間帶位與帶數(shù)有所不同,差異主要產(chǎn)生在a 區(qū)和c區(qū)的某些弱帶:在a區(qū),山銀花和九豐一號具有a1 ,而其他品種無此帶;九豐一號(3年)、雞爪花和大毛花具有a3,而其他品種無此帶,且大毛花的a3帶酶活性較強。在b區(qū),雞爪花、大毛花和盤葉忍冬具有b3帶,且雞爪花的b3帶酶活性較弱;只有九豐一號和山銀花具有b4帶,其他品種無此帶;只有大毛花和紅腺忍冬具有b5帶;只有九豐一號和紅腺忍冬具有b9帶;九豐一號(3年)和雞爪花具有b14帶,其他品種無;九豐一號(3年)和大毛花具有b15帶。在c區(qū),只有山銀花和盤葉忍冬具有c3帶;九豐一號(3年)和大毛花具有c4、c7、c8帶;九豐一號(3年)、雞爪花和大毛花具有c6帶。
注:1.九豐一號(3年),2.雞爪花,3.大毛花,4.九豐一號,5.山銀花,6~7.紅腺忍冬,8~9.盤葉忍冬。
此外,通過對九豐一號和九豐一號(3年)酶譜的比較可知,同一品種不同發(fā)育時期的POD同工酶譜也不同,即對于金銀花而言,其POD同工酶存在發(fā)育時期的差異。
因此,可以通過這些特征帶區(qū)別各個品種的金銀花,以利于對金銀花進行分析鑒別和遺傳育種研究。
2.2過氧化物同工酶酶譜聚類分析植物體內(nèi)的同工酶在一定部位、一定發(fā)育時期,其酶譜存在相對穩(wěn)定性,在一定程度上能夠反映植物個體間的遺傳差異,故同工酶作為品種遺傳性的指標(biāo)之一,已廣泛應(yīng)用于研究品種的起源演化及分類等方面。利用重心法系統(tǒng)聚類的統(tǒng)計手段,探討該種內(nèi)品種間的親緣關(guān)系,為研究品種分類提供一些酶生物化學(xué)方面的依據(jù)[10] 。
由圖3可知,大毛花和九豐一號(3年)這2個品種的相似度最高(0.62),其親緣關(guān)系也最近,其次是山銀花和盤葉忍冬(0.56)。九豐一號和紅腺忍冬的親緣關(guān)系相對較近(0.35)。由此可將這6個金銀花品種分為3類:大毛花和九豐一號(3年);山銀花和盤葉忍冬;九豐一號和紅腺忍冬。
圖36種金銀花品種UPGAMA 聚類從整體上看,大毛花、九豐一號和山銀花、盤葉忍冬這4個品種的親緣關(guān)系較近,這4個品種與九豐一號、紅腺忍冬的親緣關(guān)系則較遠。雞爪花與其他各品種之間的親緣關(guān)系相對較遠,但在大的范圍(圖上所示結(jié)點處)還可與大毛花、九豐一號(3年)、山銀花、盤葉忍冬分為一類,而與九豐一號、紅腺忍冬的親緣關(guān)系則相對更遠一些。
2.3譜帶相似度指數(shù)與親緣關(guān)系由于POD同工酶系基因表達的產(chǎn)物,也是分子水平的表現(xiàn)型,因此,POD同工酶的表現(xiàn)型差異反映了基因型的差異。從基因型差異的程度也能顯示出種間親緣關(guān)系的遠近。VAUGHAN等[11]提出以酶譜相似度預(yù)測種間親緣關(guān)系。相似度指數(shù)越高,親緣關(guān)系越近。由Vaughan公式所估算結(jié)果列于表1。
由表1可知,九豐一號(3年)與大毛花的相似度指數(shù)較高(62.4),說明它們之間的親緣關(guān)系相對較近;其次是山銀花和盤葉忍冬(57.4),再次是九豐一號和紅腺忍冬(49.3)。九豐一號(3年)和紅腺忍冬的相似度指數(shù)最低(6.4),反映了它們之間的親緣關(guān)系很遠。
該結(jié)果可能是由于結(jié)構(gòu)基因在進化過程中已發(fā)生較大的變異,或由于它們的染色體組是異源的。
3小結(jié)與討論
該研究中,金銀花幼葉POD同工酶譜分為a、b、c 3區(qū),其酶帶數(shù)分別為3、16、8。這6個金銀花栽培品種的酶帶總數(shù)為 27條,各栽培品種酶帶數(shù)為4~18 條,帶位也有差異:大毛花的酶帶數(shù)最多(18條),紅腺忍冬的酶帶數(shù)最少(4條);酶帶都較穩(wěn)定,表現(xiàn)出相似的遺傳基礎(chǔ),但各品種間帶位與帶數(shù)有所不同,差異主要產(chǎn)生在a 區(qū)和c區(qū)的某些弱帶。a2和b6都可以作為這6種金銀花栽培品種共有的固有酶帶。
九豐一號(3年)與大毛花,山銀花與盤葉忍冬,九豐一號與紅腺忍冬的相似度指數(shù)都較高,說明這幾個品種之間的親緣關(guān)系相對較近。九豐一號(3年)和紅腺忍冬的相似度最低,說明這2個品種之間的親緣關(guān)系相對較遠。金銀花幼葉POD同工酶譜帶相似度分析結(jié)果,與UPGAMA聚類分析所得結(jié)果相同,說明試驗所得結(jié)果正確,且具有可重復(fù)操作性。上述結(jié)果對于鑒定金銀花品種的真?zhèn)?、純度及金銀花的遺傳育種具有實際的指導(dǎo)意義。
九豐一號是以大毛花為親本,采用多倍體育種技術(shù)培育出的多倍體金銀花新品種,是與普通金銀花不同的四倍體植物[12]。該試驗結(jié)果表明,大毛花和九豐一號(3年)的親緣關(guān)系相對較近,但大毛花和九豐一號的親緣關(guān)系則相對較遠,不能歸于一類。
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