摘要[目的] 對6個金銀花主要栽培品種的POD同工酶進行研究，以揭示金銀花POD同工酶的變化規(guī)律。[方法]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對6個金銀花主要栽培品種的過氧化物酶（POD）同工酶譜進行分析。[結(jié)果]它們的POD酶譜條帶數(shù)在4～18，其中大毛花的酶譜帶數(shù)最多，達18條，紅腺忍冬最少，為4條，a2和b6可以作為這6種金銀花栽培品種共有的固有酶帶。九豐一號（3年）與大毛花的相似度指數(shù)較高（62.4），說明它們之間的親緣關(guān)系相對較近；其次是山銀花和盤葉忍冬（57.4），再次是九豐一號和紅腺忍冬（49.3）。九豐一號（3年）和紅腺忍冬的相似度指數(shù)最低（6.4），反映它們之間的親緣關(guān)系很遠。[結(jié)論] 為金銀花品種育種與鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 金銀花；過氧化物酶同工酶；品種鑒定；親緣關(guān)系

中圖分類號S188文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10091-03

作者簡介丁銳（1977- ），男，陜西漢中人，講師，從事資源生物開發(fā)利用研究。

金銀花（Flos lonicerae）又名金銀藤、鴛鴦藤或雙花，為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera）植物忍冬（Lonicera japonica thunb）及同屬多種植物的干燥花蕾，是一種“藥食同源”的綠色植物，其味甘性寒，具有清熱解毒功能，是臨床常用的中藥之一[1-2]。在我國，金銀花主要分布在河南（南銀花）、山東（東銀花、濟銀花）、廣西（山銀花）、湖南、廣東、湖北、安徽、四川、浙江、陜西、江蘇、江西、貴州等地[3] 。

同工酶是基因的直接表達者。隨著對同工酶結(jié)構(gòu)功能、基因表達、染色體基因定位等研究的深入，同工酶技術(shù)被成功應(yīng)用于鑒定各類植物種質(zhì)資源的地理起源、分類等。近年來在真菌菌種的鑒定工作中也得到了應(yīng)用[4] 。其中，POD同工酶的研究利用較廣泛[4-10]。

由于金銀花在我國各地區(qū)都有廣泛種植，且其品種多樣，因此，金銀花的育種工作者往往需要引進各個地區(qū)的優(yōu)良品種以培育出更加優(yōu)良的品種。在引種過程中，對金銀花品種的鑒別極其重要，因為部分性狀較差的品種與某些優(yōu)良品種具有形態(tài)學(xué)上的相似性，難以直接區(qū)分。不法人員則趁機以次充好，以假冒偽劣商品出售，破壞了金銀花市場秩序。筆者旨在對6個金銀花主要栽培品種的POD同工酶進行研究，以揭示金銀花POD同工酶的變化規(guī)律，為金銀花品種育種與鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料紅腺忍冬（四川）、山銀花（漢中）、九豐一號（山東）、盤葉忍冬（湖南）、雞爪花、大毛花（山東）。這6個金銀花品種均從陜西省漢中市南鄭陽春藥業(yè)公司金銀花種植基地采集。

1.2儀器高壓雙穩(wěn)電泳儀（DYYⅢ4型，北京六一儀器廠），垂直電泳槽（DYYⅡ28型，櫚樣品梳 24齒，北京六一儀器廠），LGR16W 高速微量冷凍離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。

1.3方法每個品種取幼葉約200 mg，在冰浴中制樣。提取緩沖液由1 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCl、1 mmol/L 抗壞血酸、16.7% 蔗糖、14 mmol/L 巰基乙醇、0.1 mmol/L TrisHCl（pH7.8）組成。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%。醋酸-聯(lián)苯胺染色。

電泳后的凝膠，利用美國BIORAD 凝膠成像系統(tǒng)，對試驗結(jié)果進行處理，應(yīng)用Quantity One4.1.0 軟件，選擇DICE 相似性系數(shù)、Neighbor Joining 進行聚類分析得聚類圖。

2結(jié)果與分析

2.1金銀花的過氧化物酶同工酶譜分析根據(jù)圖1～2酶帶的特點和遷移率的不同，將酶帶由負極到正極分為a、b、c 3個區(qū)，各區(qū)酶帶分別標(biāo)為a1～a3、b1～b16、c1～c8，遷移率分別為0.011～0.062、0.130～0.388、0.412～0.818。6個品種的酶帶總數(shù)為 27條，各栽培品種酶帶數(shù)為4～ 18 條，帶位也有差異：大毛花的酶帶數(shù)最多（18條），紅腺忍冬的酶帶數(shù)最少（4條）；酶帶都較穩(wěn)定，表現(xiàn)出相似的遺傳基礎(chǔ)，但各品種間帶位與帶數(shù)有所不同，差異主要產(chǎn)生在a 區(qū)和c區(qū)的某些弱帶：在a區(qū)，山銀花和九豐一號具有a1 ，而其他品種無此帶；九豐一號（3年）、雞爪花和大毛花具有a3，而其他品種無此帶，且大毛花的a3帶酶活性較強。在b區(qū)，雞爪花、大毛花和盤葉忍冬具有b3帶，且雞爪花的b3帶酶活性較弱；只有九豐一號和山銀花具有b4帶，其他品種無此帶；只有大毛花和紅腺忍冬具有b5帶；只有九豐一號和紅腺忍冬具有b9帶；九豐一號（3年）和雞爪花具有b14帶，其他品種無；九豐一號（3年）和大毛花具有b15帶。在c區(qū)，只有山銀花和盤葉忍冬具有c3帶；九豐一號（3年）和大毛花具有c4、c7、c8帶；九豐一號（3年）、雞爪花和大毛花具有c6帶。

注：1.九豐一號（3年），2.雞爪花，3.大毛花，4.九豐一號，5.山銀花，6～7.紅腺忍冬，8～9.盤葉忍冬。

此外，通過對九豐一號和九豐一號（3年）酶譜的比較可知，同一品種不同發(fā)育時期的POD同工酶譜也不同，即對于金銀花而言，其POD同工酶存在發(fā)育時期的差異。

因此，可以通過這些特征帶區(qū)別各個品種的金銀花，以利于對金銀花進行分析鑒別和遺傳育種研究。

2.2過氧化物同工酶酶譜聚類分析植物體內(nèi)的同工酶在一定部位、一定發(fā)育時期，其酶譜存在相對穩(wěn)定性，在一定程度上能夠反映植物個體間的遺傳差異，故同工酶作為品種遺傳性的指標(biāo)之一，已廣泛應(yīng)用于研究品種的起源演化及分類等方面。利用重心法系統(tǒng)聚類的統(tǒng)計手段，探討該種內(nèi)品種間的親緣關(guān)系，為研究品種分類提供一些酶生物化學(xué)方面的依據(jù)[10] 。

由圖3可知，大毛花和九豐一號（3年）這2個品種的相似度最高（0.62），其親緣關(guān)系也最近，其次是山銀花和盤葉忍冬（0.56）。九豐一號和紅腺忍冬的親緣關(guān)系相對較近（0.35）。由此可將這6個金銀花品種分為3類：大毛花和九豐一號（3年）；山銀花和盤葉忍冬；九豐一號和紅腺忍冬。

圖36種金銀花品種UPGAMA 聚類從整體上看，大毛花、九豐一號和山銀花、盤葉忍冬這4個品種的親緣關(guān)系較近，這4個品種與九豐一號、紅腺忍冬的親緣關(guān)系則較遠。雞爪花與其他各品種之間的親緣關(guān)系相對較遠，但在大的范圍（圖上所示結(jié)點處）還可與大毛花、九豐一號（3年）、山銀花、盤葉忍冬分為一類，而與九豐一號、紅腺忍冬的親緣關(guān)系則相對更遠一些。

2.3譜帶相似度指數(shù)與親緣關(guān)系由于POD同工酶系基因表達的產(chǎn)物，也是分子水平的表現(xiàn)型，因此，POD同工酶的表現(xiàn)型差異反映了基因型的差異。從基因型差異的程度也能顯示出種間親緣關(guān)系的遠近。VAUGHAN等[11]提出以酶譜相似度預(yù)測種間親緣關(guān)系。相似度指數(shù)越高，親緣關(guān)系越近。由Vaughan公式所估算結(jié)果列于表1。

由表1可知，九豐一號（3年）與大毛花的相似度指數(shù)較高（62.4），說明它們之間的親緣關(guān)系相對較近；其次是山銀花和盤葉忍冬（57.4），再次是九豐一號和紅腺忍冬（49.3）。九豐一號（3年）和紅腺忍冬的相似度指數(shù)最低（6.4），反映了它們之間的親緣關(guān)系很遠。

該結(jié)果可能是由于結(jié)構(gòu)基因在進化過程中已發(fā)生較大的變異，或由于它們的染色體組是異源的。

3小結(jié)與討論

該研究中，金銀花幼葉POD同工酶譜分為a、b、c 3區(qū)，其酶帶數(shù)分別為3、16、8。這6個金銀花栽培品種的酶帶總數(shù)為 27條，各栽培品種酶帶數(shù)為4～18 條，帶位也有差異：大毛花的酶帶數(shù)最多（18條），紅腺忍冬的酶帶數(shù)最少（4條）；酶帶都較穩(wěn)定，表現(xiàn)出相似的遺傳基礎(chǔ)，但各品種間帶位與帶數(shù)有所不同，差異主要產(chǎn)生在a 區(qū)和c區(qū)的某些弱帶。a2和b6都可以作為這6種金銀花栽培品種共有的固有酶帶。

九豐一號（3年）與大毛花，山銀花與盤葉忍冬，九豐一號與紅腺忍冬的相似度指數(shù)都較高，說明這幾個品種之間的親緣關(guān)系相對較近。九豐一號（3年）和紅腺忍冬的相似度最低，說明這2個品種之間的親緣關(guān)系相對較遠。金銀花幼葉POD同工酶譜帶相似度分析結(jié)果，與UPGAMA聚類分析所得結(jié)果相同，說明試驗所得結(jié)果正確，且具有可重復(fù)操作性。上述結(jié)果對于鑒定金銀花品種的真?zhèn)?、純度及金銀花的遺傳育種具有實際的指導(dǎo)意義。

九豐一號是以大毛花為親本，采用多倍體育種技術(shù)培育出的多倍體金銀花新品種，是與普通金銀花不同的四倍體植物[12]。該試驗結(jié)果表明，大毛花和九豐一號（3年）的親緣關(guān)系相對較近，但大毛花和九豐一號的親緣關(guān)系則相對較遠，不能歸于一類。

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