摘要 從茶樹外植體的選取、表面滅菌、培養(yǎng)基的確定及生長調(diào)節(jié)物質的確定等方面對茶樹組織培養(yǎng)技術體系的研究進行綜述，指出目前研究中存在的問題，并對今后的研究進行了展望，為進一步開展茶樹組織培養(yǎng)研究提供參考。

關鍵詞 茶樹；組織培養(yǎng)；滅菌；培養(yǎng)基

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10086-02

基金項目湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項目（2011620005003-04）。

作者簡介曹丹（1988-），女，河南開封人，研究實習員，碩士，從事茶資源與育種研究。*通訊作者。

茶樹[Camellia sinensis （L.） O. Kuntze]屬于山茶科山茶屬茶組，是多年生常綠異花授粉木本植物。其葉經(jīng)過加工后的飲品是世界上三大消費量最大的飲料之一，具有營養(yǎng)價值和保健功效[1]。

組織培養(yǎng)技術既可用于大量生產(chǎn)優(yōu)良無性系植株，又可打破種屬間的界限，克服遠緣雜交不親和等障礙，對于開展茶樹種質資源的保存、新品種的培育及種性改良等方面的研究具有重要意義。茶樹組織培養(yǎng)技術的研究于20世紀60年代開始，英國劍橋大學以茶樹幼嫩莖段為材料研究離體咖啡堿的合成[2]，目前已在次級代謝的研究、次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、茶苗的繁殖、誘導單倍體植株和種質資源的保存等方面取得了較多的成果。筆者就目前國內(nèi)外茶樹組織培養(yǎng)現(xiàn)狀及問題進行綜述，旨在為研究和優(yōu)化茶樹組織培養(yǎng)技術，對茶樹育種及良種繁育等方面的研究提供參考。

1研究現(xiàn)狀

1.1外植體的選取外植體的選擇對組織培養(yǎng)技術至關重要。目前，茶樹已經(jīng)成功地從莖尖[3-4]、莖段[5-9]、腋芽[10-12]、子葉[13-14]、葉片[15-16]、胚[17-19]、下胚軸[20]和花藥[21]等成熟或未成熟組織中通過愈傷組織或者直接產(chǎn)生不定芽的方式進行器官發(fā)生和植株再生。外植體供體植株間的差異也將影響外植體的生理狀態(tài)，進而影響組織培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生。一般而言，較小的外植體再生能力較弱，而大的則強。此外，多數(shù)研究者傾向于采用春季新梢及冬季催芽萌發(fā)的嫩莖作為芽和莖的材料，且室內(nèi)控制條件下培養(yǎng)的實生苗和組培苗比田間生長的茶樹污染輕，消毒處理也較方便，是組織和器官培養(yǎng)較好的材料來源[22]。

1.2外植體的滅菌外植體的滅菌是組織培養(yǎng)的關鍵步驟。接種前應對外植體進行徹底的表面消毒和深度滅菌[23]，外植體消毒的常用方法有用洗衣粉清理表面、自來水沖洗、置超凈工作臺、75%乙醇消毒處理、消毒劑處理（常用的消毒劑有次氯酸鈉、升汞等）及無菌水沖洗等。

譚和平等[24]以茶樹腋芽為外植體，先用水沖洗干凈，70%乙醇浸15～30 s，再用0.1%的氯化汞溶液消毒8～12 min，無菌水洗5次。易鑫等[25]采用正交試驗研究茶樹外植體的最佳消毒方式，結果表明，在適量的洗衣粉溶液中洗滌5 min后，置于自來水下沖洗2 h。將外植體用75%的乙醇溶液浸泡30 s，再用0.1%的氯化汞滅菌，當把滅菌時間設定為8 min時，滅菌效果最好。

1.3培養(yǎng)基的確定在茶樹組織培養(yǎng)中，常將MS作為基本培養(yǎng)基。張婭婷等[8]以MS、White和N6為基本培養(yǎng)基，附加等量的維生素、氨基酸、糖和植物生長調(diào)節(jié)劑，對藪北茶芽苗進行培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，MS基本培養(yǎng)基效果優(yōu)于White和N6基本培養(yǎng)基。楊國偉等[26]研究發(fā)現(xiàn)，MS比White、Heller培養(yǎng)基更有利于茶樹愈傷組織的生長，茶樹愈傷組織在MS培養(yǎng)基上誘導率高達90%。Haldeman也比較了MS與Anderson’s Rhodo dendron培養(yǎng)基對茶樹愈傷組織培養(yǎng)的效果，結果表明，MS培養(yǎng)基效果最佳。

研究表明，基本培養(yǎng)基中大量元素的含量對茶樹組織培養(yǎng)影響很大，成浩等[27]發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基大量元素降為原來的1/2，不僅可以促進莖段的誘導和生長，也可以降低莖段的褐化率。但在實際操作中，大多數(shù)研究者分別采用全量的大量元素進行誘導與增殖，采用半量的大量元素進行生根培養(yǎng)。

1.4生長調(diào)節(jié)劑的確定生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關鍵物質，其種類與配比是外植體能否成功啟動的關鍵因素之一。因器官不同，其激素水平存在差異，且對外源性的生長調(diào)節(jié)物質的敏感性也不同，故不同品種及不同類型的外植體對不同生長調(diào)節(jié)劑的種類和配比反應也不同。在快速繁殖時，通常生長素含量應稍低，這是因為生長素含量過高易導致愈傷組織的形成，而愈傷組織的形成會降低增殖率。此外，細胞分裂素含量高時將會阻礙愈傷組織的形成，而有利于芽的誘導和生長。劉德華等[28]、李家華等[29]和張建華等[30]在沒有添加BA的情況下，無叢生芽長出，而在添加高濃度BA的情況下長出了叢生芽。在生根培養(yǎng)中，一般認為先對外植體進行預處理，再轉入新的培養(yǎng)基有利于提高其生根率，一般采用IBA進行預處理，但生根率不受IBA預處理時間的影響，而主要受IBA濃度的影響[27]。

1.5其他茶樹組織培養(yǎng)除與培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑等相關外，還與培養(yǎng)環(huán)境有關。劉德華等[31]研究發(fā)現(xiàn)，子葉片隆起發(fā)生率在一定程度內(nèi)與光照強度呈負相關，子葉胚的胚狀體和不定芽分化率在一定程度內(nèi)與光照強度呈正相關。鐘俊輝等[32]研究發(fā)現(xiàn)，促進茶氨酸累積和茶細胞生長的最佳溫度是25 ℃，而在32 ℃或35 ℃下進行培養(yǎng)，愈傷組織將會褐變，甚至枯死，且暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更能促進茶氨酸的聚集。

2存在問題與措施

從20世紀初開始，植物組織培養(yǎng)技術已成功應用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和醫(yī)藥業(yè)等領域，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。褐化、污染和玻璃化是植物組織培養(yǎng)公認的三大難題[33-34]。茶樹因多酚含量高，且自身攜帶較多內(nèi)生菌，在試驗過程中會出現(xiàn)外植體、污染等問題。

2.1外植體褐化茶樹中的酚類物質含量較高，而進行組織培養(yǎng)時，由于外植體要進行切割造成傷口，使得多酚類物質與底物多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的隔離被打破，遇到氧氣發(fā)生氧化反應產(chǎn)生褐色物質，褐色物質逐漸擴散到整個培養(yǎng)基，最終造成外植體褐變[35]。此外，外植體褐變還與外植體部位、取樣時間、培養(yǎng)基成分和消毒方式等因素有關。黃燕芬等[36]探討了外植體的滅菌時間、激素比例、取樣方式及外源物質等因素在茶樹組織培養(yǎng)過程中對外植體褐化程度的影響，結果表明，外植體用0.1%的升汞表面消毒7～8 min，接種外植體帶腋芽葉片保留2/5，每隔3 d進行一次轉瓶，培養(yǎng)基中添加1.0 g/L Vc和1.0 g/L吸附劑AC，能將外植體的褐化率降至41%。

減少外植體的褐化，主要從以下幾個方面著手：①選擇適當?shù)耐庵搀w。從生長健壯的植株上選取發(fā)育正常的部位作為外植體，在組織培養(yǎng)過程中不易發(fā)生褐變，在取樣時還需注重基因型的選擇，可以將不易發(fā)生褐變的品種作為外植體。②吸附劑與抑制劑的使用。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑及其他抑制劑能有效減輕外植體在組織培養(yǎng)過程中的酶促褐變，如在培養(yǎng)基中加入多羥基還原物質Vc，另外，可作為抑制劑的物質如氰化鉀、氨基酸、蛋白水解產(chǎn)物、多胺等都可用來防止褐變現(xiàn)象。此外，活性炭吸附性強，可以用來吸附培養(yǎng)基中的醌和酚等有害物質，減輕褐變，同時培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物質也將被吸附，故在培養(yǎng)基中加入活性炭時也需注意不同激素間的配比，在防止褐變的同時能保證外植體的正常發(fā)育。③及時轉瓶。接種后，每隔3～5 d轉瓶一次，可有效減少酚類物質在培養(yǎng)基中的富集，有效減輕褐變。④改善培養(yǎng)條件。接種后先在低溫或者黑暗中預陪養(yǎng)幾天可降低褐化程度。

2.2外植體污染外植體污染是植物組織培養(yǎng)中普遍存在的問題。茶樹組織培養(yǎng)分為一般性污染和內(nèi)源性污染。一般性污染是針對不同類型外植體選擇的消毒劑不當，導致材料消毒不徹底或是實驗人員在操作過程中未嚴格按照要求進行操作從而導致的污染。一般性污染可采取一定措施盡量降低或避免。而內(nèi)源性污染是茶樹自身攜帶的內(nèi)生菌引起的，且茶樹內(nèi)生菌含量較豐富，在對其進行組織培養(yǎng)時極易發(fā)生內(nèi)生菌污染，其防治十分困難。

目前有關防治茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的報道較少，故今后應深入開展這方面的研究。

3展望

茶樹組織培養(yǎng)技術雖然在多方面取得了較大成就，但在基礎研究方面以及進一步優(yōu)化次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)條件、利用組培技術快速大量繁殖茶樹種質資源、提高茶樹組織培養(yǎng)的再生頻率等方面的研究還需繼續(xù)加強。另外，由于茶樹離體再生較困難且轉化效率極低[37]，雖然目前在對茶樹遺傳轉化的探索較多，但突破性的進展較少，故應加強相關方面的研究。

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