摘要[目的]研究離子液體1乙基3甲基咪唑磷酸二乙酯磷酸鹽（〔Emim〕DEP）對釀酒酵母SY101生長的影響。[方法]用顯微鏡觀察了不同〔Emim〕DEP濃度下液體培養(yǎng)基中對數(shù)生長期酵母細(xì)胞的形態(tài)及出芽情況，用分光光度法測得的數(shù)值繪制出酵母菌24 h生長曲線。[結(jié)果]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，〔Emim〕DEP對釀酒酵母SY101生長有抑制性，隨著〔Emim〕DEP濃度的增加，抑制作用越明顯。當(dāng)〔Emim〕DEP濃度高于3 g/L 時(shí)，酵母菌的形態(tài)發(fā)生明顯改變；濃度高于10 g/L 時(shí)，酵母菌的出芽率明顯下降。通過平板培養(yǎng)測得〔Emim〕DEP對酵母菌的半有效濃度EC50值為6.67 g/L 。[結(jié)論] 研究可為由離子液體從農(nóng)林廢棄物中制備納米纖維素后的殘?jiān)l(fā)酵燃料酒精的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 離子液體〔Emim〕DEP；釀酒酵母SY101；生長影響；EC50

中圖分類號S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10299-03

基金項(xiàng)目海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目《TiO2/纖維素納米復(fù)合膜材料的制備及其吸附性能研究》（514218）；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本級基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（1630062013012）。

作者簡介王曉芳（1982- ），女，安徽定遠(yuǎn)人，助理研究員，碩士，從事食品工程及微生物發(fā)酵方面的研究。

離子液體又稱低溫熔融鹽，作為一種新興的綠色溶劑，其巨大的應(yīng)用潛力已在整個(gè)科學(xué)界達(dá)成共識[1]。納米纖維素作為功能材料，其表現(xiàn)出的高比表面積及高強(qiáng)度等優(yōu)良特性，日益受到各界的廣泛關(guān)注，蘊(yùn)藏著無限商機(jī)和美好的發(fā)展前景。農(nóng)林廢棄物中含有大量優(yōu)質(zhì)纖維素[2]，是制備納米纖維素的豐富原料，且綠色環(huán)保[3]。目前從農(nóng)林廢棄物中提取納米纖維素的方法有化學(xué)處理法、酶解法、生物（細(xì)菌）制備法、物理法、人工合成法[4]以及離子液體均相制備法，其中用離子液體均相法制備納米纖維素是一種工藝簡單、環(huán)境友好的納米纖維素制備方法[5]。制備納米纖維素后剩余的殘?jiān)腥匀粴埩舸罅康睦w維素，轉(zhuǎn)換為可還原糖后可被釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇，有效提高農(nóng)林廢棄物綜合利用率。但離子液體對釀酒酵母生長繁殖的影響等情況鮮有報(bào)道，筆者初步研究了離子液體1乙基3甲基咪唑磷酸二乙酯磷酸鹽（〔Emim〕DEP）對釀酒酵母SY101（Saccharomyces cerevisiae SY101）生長的影響，觀察了對數(shù)生長期〔Emim〕DEP對該菌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和出芽率的影響，尋找〔Emin〕DEP對釀酒酵母菌的半有效濃度（EC50），旨在為由離子液體從農(nóng)林廢棄物中制備納米纖維素后的殘?jiān)l(fā)酵燃料酒精的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株與材料試驗(yàn)菌株釀酒酵母SY101（Saccharomyces cerevisiae SY101），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實(shí)驗(yàn)室保藏；離子液體〔Emin〕DEP由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實(shí)驗(yàn)室制備，純度達(dá)95%；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法所有試驗(yàn)均重復(fù)4次，文中給出的數(shù)據(jù)為4次試驗(yàn)的平均值，試驗(yàn)相對誤差控制在5%以內(nèi)。

1.2.1菌種培養(yǎng)基的制備。取保存于低溫冰箱的釀酒酵母菌株接種于100 ml（裝于250 ml錐形瓶）滅菌的液體YPD培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱30 ℃、200 r/min活化24 h，活化的菌液稀釋6倍后接種于YPD平板培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落接種于100 ml錐形瓶（容量為250 ml）液體YPD培養(yǎng)基中，置于振蕩恒溫箱30 ℃、振幅5 cm、轉(zhuǎn)速為200 r/min培養(yǎng)24 h活化。該菌液用于后續(xù)試驗(yàn)中的平板培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)的菌種。該試驗(yàn)過程中所用到的培養(yǎng)基的組成：YPD平板培養(yǎng)基，酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L；YPD液體培養(yǎng)基，酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。上述培養(yǎng)基根據(jù)需要，在其中加入適量的離子液體〔Emim〕DEP，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2〔Emin〕DEP對酵母菌SY101在平板培養(yǎng)基生長影響的測定。無菌操作下將上述活化后的酵母菌液10倍梯度稀釋6次（經(jīng)多次涂布經(jīng)驗(yàn)得出稀釋6次后的效果較好）。然后吸取200 μl不同濃度的菌液均勻地涂布到含有〔Emim〕DEP濃度分別為0、0.01、0.10、1.00、3.00、5.00、10.00、12.00 g/L的YPD平板培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察記錄每個(gè)平板中的菌落數(shù)（CFU）及菌落直徑。

1.2.3〔Emin〕DEP對酵母菌SY101在液體培養(yǎng)基生長影響的測定。同“1.2.2”，各取1.0 ml上述活化的釀酒酵母菌液無菌操作加入分別裝有不同濃度〔Emin〕DEP的99 ml YPD液體培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，然后30 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。YPD液體培養(yǎng)基中設(shè)置〔Emin〕DEP的濃度梯度分別為0、0.01、0.10、1.00、3.00、5.00、10.00、12.00 g/L。培養(yǎng)過程中，間隔一定時(shí)間分別取樣（前期12 h每隔2 h，后期12 h每隔4 h）。將樣品用無菌水稀釋10倍后，以未加藥物和酵母菌的液體YPD培養(yǎng)基為對照，用722型分光光度計(jì)分別測定其在600 nm處的吸光度值（OD600 nm），再以培養(yǎng)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)、OD600 nm為縱坐標(biāo)繪制其24 h的生長曲線[6]。

2結(jié)果與分析

2.1離子液體〔Emin〕DEP對釀酒酵母SY101菌落的半效應(yīng)濃度（EC50）及菌落生長直徑的影響半有效濃度（EC50）是毒性研究中的重要指標(biāo)，可以比較快速地判斷被試藥物對微生物可能產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步作慢性毒性研究提供依據(jù)。表1給出了不同〔Emin〕DEP的YPD平板培養(yǎng)基上酵母菌SY101培養(yǎng)48 h后的菌落形成單位數(shù)（CFU）及平均菌落直徑。由表1可知，當(dāng)〔Emin〕DEP濃度高于12.00 g/L時(shí)，該酵母菌的平板上就不再出現(xiàn)生長菌落，且隨著〔Emin〕DEP濃度的增加，菌落數(shù)在不斷減少，單個(gè)菌落直徑也在不斷減?。▓D1），這也從側(cè)面佐證了〔Emin〕DEP對該酵母菌有抑制作用，當(dāng)〔Emin〕DEP濃度達(dá)到3.00 g/L時(shí)，抑制作用趨于明顯。通過對表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到〔Emin〕DEP對該菌的毒力回歸方程Y=2.115 6X+0.897 9，R2=0.952 1，得出〔Emin〕DEP對酵母菌SY101的半有效濃度EC50為6.67 g/L（即在平板培養(yǎng)時(shí)CFU數(shù)為空白對照一半所對應(yīng)的〔Emin〕DEP濃度）。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的劉洋洋等于2012年8月份發(fā)表的文章稱：當(dāng)離子液體氯化1丁基3甲基咪唑〔Bmim〕Cl濃度為5.000 mg/ml時(shí)，釀酒酵母AS2.399在液體YPD培養(yǎng)基中的濃度為對照組的57%[7]；余培等于2013年11月份報(bào)道，1乙基3甲基咪唑醋酸鹽〔Emin〕AC對酵母菌AY93161的半有效濃度EC50為4.45 g/L[8]。與上述數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后可得出，〔Emin〕DEP對酵母菌的毒性較溫和。

2.2不同離子液體〔Emin〕DEP濃度梯度下的釀酒酵母SY101的生長曲線如圖2所示，酵母菌SY101的生長曲線隨著〔Emin〕DEP濃度的不同而變化，當(dāng)〔Emin〕DEP濃度低于5.00 g/L時(shí)，酵母菌的生長曲線有著明顯的遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期；當(dāng)濃度達(dá)到及高于10.00 g/L時(shí)，曲線變化不明顯，濃度達(dá)到12.00 g/L時(shí)，菌體生長被嚴(yán)重抑制，在培養(yǎng)基中的增幅很小。分析認(rèn)為，高濃度〔Emin〕DEP抑制了該菌的生長繁殖，從而降低培養(yǎng)液中的菌體濃度，反映在生長曲線上則提前進(jìn)入穩(wěn)定期。說明〔Emin〕DEP對酵母菌的生長有抑制作用，且隨著濃度的加大，抑制作用逐步加強(qiáng)。

2.3離子液體〔Emin〕DEP對酵母菌SY101形態(tài)及出芽率的影響根據(jù)繪制出的酵母菌SY101在24 h內(nèi)的生長曲線圖（圖2）可以直觀地看出，該酵母菌的對數(shù)生長期約在培養(yǎng)后的8～10 h，此時(shí)的菌體活力最佳。將上述不同濃度梯度〔Emin〕DEP培養(yǎng)液的對數(shù)生長期樣品于顯微鏡（粵顯牌L3200型）的40倍視野下觀察該酵母菌的細(xì)胞形態(tài)和出芽情況（圖3）。

由圖3可知，隨著〔Emin〕DEP濃度的增加，酵母菌SY101的單細(xì)胞形態(tài)逐漸由橢圓形變得圓潤，出芽率也隨之下降。當(dāng)〔Emin〕DEP 濃度達(dá)到3.00 g/L時(shí)，酵母菌的單細(xì)胞形態(tài)明顯變圓，說明高濃度〔Emin〕DEP會(huì)導(dǎo)致該酵母菌的形態(tài)發(fā)生變化。在〔Emin〕DEP濃度達(dá)到10.00 g/L時(shí)，酵母菌的出芽率明顯下降，說明高濃度的〔Emin〕DEP會(huì)抑制該酵母菌的增殖力。由上所述，分析認(rèn)為有可能是高濃度的〔Emin〕DEP引起高滲透壓，導(dǎo)致該酵母菌新陳代謝紊亂，影響其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，從而使酵母菌活力下降。圖3不同〔Emin〕DEP濃度梯度液體YPD培養(yǎng)基中釀酒酵母SY101的形態(tài)和出芽情況3結(jié)論

該研究設(shè)置了單因素試驗(yàn)，考察了離子液體〔Emin〕DEP對釀酒酵母SY101生長繁殖的影響，主要結(jié)論如下： ① 離子液體〔Emin〕DEP濃度低時(shí)，不會(huì)改變酵母菌單細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和出芽率，濃度增大時(shí)會(huì)使單細(xì)胞形態(tài)變得圓潤，該酵母菌的出芽率也會(huì)隨著〔Emin〕DEP濃度升高而降低。② 離子液體〔Emin〕DEP對釀酒酵母SY101的半有效濃度EC50為6.67 g/L。相比較于其他咪唑類離子液體（如〔Emin〕AC對釀酒酵母AY93161的半有效濃度EC50為4.45 g/L），〔Emin〕DEP對該酵母菌的毒性較小，說明〔Emin〕DEP是一種毒性較溫和的離子液體，作為溶劑從廢棄農(nóng)作物纖維中提取納米纖維素后，殘留的離子液體（一般濃度會(huì)大于10 g/L）會(huì)對后續(xù)的酒精發(fā)酵產(chǎn)生影響，需要經(jīng)過處理，降低其濃度才能接種酵母進(jìn)行發(fā)酵利用。

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