摘要[目的] 研究不同溶劑的假蒟葉提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)的影響。[方法] 在模擬胃液條件下，測(cè)定假蒟葉提取物亞硝酸鹽清除率及亞硝胺合成阻斷率。[結(jié)果] 不同溶劑的假蒟提取物均有一定的抑制亞硝化反應(yīng)作用，其中乙酸乙酯提取物的抑制作用最強(qiáng)，且其對(duì)亞硝酸鹽的清除率及對(duì)亞硝胺合成的阻斷率在一定的濃度范圍內(nèi)隨其濃度的增加而增加，對(duì)亞硝酸鹽清除能力較強(qiáng)，其IC50值為0.425 mg/ml，對(duì)亞硝胺合成阻斷的能力相對(duì)較低，其IC50值為4.064 mg/ml。[結(jié)論] 假蒟葉提取物具有較好的亞硝化反應(yīng)抑制活性且主要通過清除底物亞硝酸鹽來實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 假蒟葉；提取物；清除亞硝酸鹽；亞硝胺合成阻斷

中圖分類號(hào)S601.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）29-10326-02

基金項(xiàng)目國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310566007）；農(nóng)產(chǎn)品加工省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地、農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（201306）。

作者簡(jiǎn)介周斯儀（1992-），女，廣東汕尾人，本科生，專業(yè)：食品科學(xué)與工程。*通訊作者，講師，博士，從事食品功能因子及功效評(píng)價(jià)方面的研究。

亞硝酸鹽廣泛存在于土壤、水和動(dòng)植物體內(nèi)，也可由硝酸鹽轉(zhuǎn)化而來，還可作為發(fā)色劑和抑菌劑廣泛應(yīng)用于食品加工。亞硝酸鹽對(duì)人體具有一定的危害性，不僅能將血紅蛋白中的二價(jià)鐵氧化成三價(jià)鐵，導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥[1]；而且在酸性條件下，亞硝酸根可與食品或人體內(nèi)的胺類發(fā)生亞硝化反應(yīng)，生成N亞硝胺類化合物。亞硝胺進(jìn)入人體后，主要經(jīng)過肝微粒體內(nèi)細(xì)胞色素P450酶的代謝活化，生成烷基偶氮羥基化合物，此類代謝產(chǎn)物具有很強(qiáng)的致癌和致突變活性[2]。亞硝胺是目前所知的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)之一，它能引起人和動(dòng)物胃、肝臟等多種臟器的惡性腫瘤[3]。除了通過直接攝入外，亞硝胺在人體胃腸道的酸性環(huán)境中，特別是胃液中更適于合成亞硝胺[4]，雖然正常情況下不會(huì)對(duì)身體造成危害，但如果攝入過多亞硝酸鹽，體內(nèi)產(chǎn)生過多的亞硝胺，會(huì)增加誘發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，清除亞硝胺生成前體物或阻斷亞硝胺在體內(nèi)的合成，是防癌抗癌的有效途徑之一，篩選出對(duì)亞硝化反應(yīng)具有抑制作用的植物成分是一項(xiàng)具有積極意義的課題。

假蒟（Piper sarmentosum Roxb.）是胡椒科胡椒屬植物，廣泛分布在我國(guó)東南沿海地區(qū)和東南亞國(guó)家，是當(dāng)?shù)貜V為使用的調(diào)味品和藥用植物。前人研究提示，假蒟富含多種活性成分，具有抗氧化、抑菌、抑癌等作用[5-9]，但假蒟提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)的影響未見報(bào)道。筆者通過模擬人體胃液條件下，不同極性溶劑的假蒟提取物對(duì)清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的作用，并篩選出了具有良好作用效果的組分，以期為假蒟的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料假蒟葉：2013年12月，采摘于廣東省湛江市湖光巖，洗凈后陰干備用。主要試劑：胃蛋白酶（酶活600～1 000 U/mg），北京鼎國(guó)昌盛生物；石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、60%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、鹽酸、氯化鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、α萘胺、二甲胺等試劑，均為分析純。主要儀器設(shè)備：KQ500DB數(shù)控超聲波清洗器，N1000DW旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，CR22GⅢ冷凍干燥機(jī)，WD-9403C紫外儀，UV3200PC可見紫外分光光度計(jì)，HH.S216數(shù)顯水浴鍋，AUW120電子天平。

1.2方法

1.2.1假蒟浸提物的制備。陰干后的假蒟葉粉碎至80目，分別用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、60%乙醇、95%乙醇、無水乙醇和水按1∶20 g/ml的料液比配置，并用400 W超聲波助提30 min后，在45 ℃水浴浸提4 h，然后經(jīng)抽濾、減壓旋轉(zhuǎn)濃縮和真空干燥，即得不同溶劑提取物。

1.2.2模擬胃液的制備。稱取2.0 g NaCl加去離子水溶解，加入7 ml濃HCl，加6.0 g的胃蛋白酶，加去離子水定容至1 000 ml。

1.2.3亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取0.100 0 g于硅膠干燥器中干燥24 h，加水溶解移入500 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，亞硝酸鈉儲(chǔ)備液（200 μg/ml），避光保存?zhèn)溆?。臨用前，吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 ml，置于200 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液A（5.0 μg/ml）；吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液69.00 ml，置于200 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液B（1.0 mmol/L）。

1.2.4亞硝酸鹽清除率的測(cè)定。采用鹽酸萘乙二胺法[10]，在弱酸條件下，亞硝酸鈉與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化后，與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，用分光光度計(jì)測(cè)出吸光率，經(jīng)計(jì)算即可得出提取物在模擬胃酸條件下對(duì)亞硝酸鹽的清除率。

取25 ml比色管，加入10 ml模擬胃液于37 ℃水浴10 min取出，再加入1 ml的假蒟葉提取物和2 ml的5.0 μg/ml亞硝酸鈉，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液2 ml ，混勻，靜置4 min后各加入2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液1 ml，加去離子水至刻度，混勻，靜置 20 min，用2 cm比色杯于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)吸光度A1。

空白對(duì)照組：以去離子水代替亞硝酸鈉標(biāo)液的空白對(duì)照試驗(yàn)測(cè)得吸光度A01；以去離子水代替假蒟葉提取物溶液的空白對(duì)照試驗(yàn)測(cè)得吸光度A02。

亞硝酸鹽清除率（%）=[（ A01+A02-A1）/A02]×100%

式中，A1，加假蒟葉提取液的測(cè)定值；A01，去離子水代替亞硝酸鈉標(biāo)液的空白對(duì)照組的測(cè)定值；A02，以去離子水代替假蒟葉提取物溶液的空白對(duì)照組的測(cè)定值。

1.2.5亞硝酸胺合成阻斷率測(cè)定。采用α萘胺法[11-12]。在模擬胃液條件下，亞硝酸鈉與二甲胺生成二甲基亞硝胺。紫外光照下，二甲基亞硝胺可分解成甲基仲胺和亞硝酸根，亞硝酸根與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，再與α萘胺耦合生成紅色化合物，用分光光度計(jì)測(cè)出吸光度值，經(jīng)計(jì)算即可得出模擬胃液條件下樣品對(duì)亞硝胺合成的阻斷率。

取5支25 ml比色管中加入模擬胃液10 ml，分別加入1 ml的樣品或?qū)φ战M，再加入濃度1 mmol/L的二甲胺溶液1 ml，1 mmol/L的NaNO2溶液1 ml，用蒸餾水稀釋至刻度，在37 ℃恒溫水浴1 h。用移液管吸取2 ml上述溶液加到試管和培養(yǎng)皿，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%Na2CO3溶液1 ml，于紫外分析儀（波長(zhǎng)254 nm）上斜放照射15 min。取出后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%對(duì)氨基苯磺酸3 ml，搖勻后靜置3～5 min，再加入α萘胺3 ml，搖勻靜置20 min，在波長(zhǎng)538 nm下測(cè)定吸光度A2。以去離子水代替亞硝酸鈉標(biāo)液的空白對(duì)照試驗(yàn)，測(cè)得吸光度A03；以去離子水代替假蒟葉粗提取液的空白對(duì)照試驗(yàn)測(cè)得吸光度A04。

亞硝胺合成的阻斷率（%）=[（A03+A04-A2）/A04]×100%

式中，A2，加假蒟葉提取物的測(cè)定值；A03，去離子水代替亞硝酸鈉標(biāo)液的空白對(duì)照組的測(cè)定值；A04，以去離子水代替假蒟葉提取物溶液的空白對(duì)照組的測(cè)定值。

2結(jié)果與分析

2.1不同溶劑的假蒟葉提取物對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響由圖1可以看出，在模擬胃液條件下，8種不同溶劑的假蒟葉提取物對(duì)亞硝酸鹽均有一定的清除作用，其對(duì)亞硝酸鹽的清除活性強(qiáng)弱依次為：乙酸乙酯>無水乙醇>石油醚>60%乙醇>95%乙醇>氯仿>正丁醇>水。其中乙酸乙酯提取物（0.05%）清除亞硝酸鹽的能力最強(qiáng)，高達(dá)99.187%，與同濃度的陽性對(duì)照VC對(duì)亞硝酸鹽的清除率相當(dāng)，其他各提取物清除亞硝酸鹽的能力明顯弱于VC，水提取物的清除率最低。

圖1不同溶劑的假蒟葉提取物對(duì)亞硝酸鈉清除率的比較2.2不同溶劑的假蒟葉提取物對(duì)亞硝胺合成阻斷率的影響由圖2可以看出，在模擬胃液條件下，8種不同溶劑的假蒟提取物對(duì)亞硝胺合成均有一定的阻斷作用，其對(duì)亞硝胺合成阻斷活性強(qiáng)弱依次為：95%乙醇>乙酸乙酯>60%乙醇>無水乙醇>正丁醇>石油醚>氯仿>水。其中95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物（0.05%）對(duì)亞硝胺合成阻斷的能力最強(qiáng)，高于43.842%，接近同濃度的陽性對(duì)照VC的作用，其他各提取物阻斷亞硝胺合成的能力明顯弱于VC，水提取物的阻斷率較低。綜合分析不同提取物對(duì)亞硝酸鹽清除能力和亞硝胺合成阻斷率的影響，乙酸乙酯提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制能力最強(qiáng)，因此對(duì)其作進(jìn)一步的量效分析。