摘要[目的]研究復(fù)凝聚法制備以明膠和阿拉伯膠為壁材的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）微膠囊的工藝。[方法]通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了明膠濃度、阿拉伯膠濃度、芯壁比、pH、反應(yīng)溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)微膠囊包埋效率的影響，再通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳制備條件；利用光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡和粒徑測(cè)微儀對(duì)球孢白僵菌微膠囊形態(tài)及粒徑分布進(jìn)行表征。[結(jié)果]復(fù)凝聚法制備球孢白僵菌微膠囊最佳工藝條件為明膠濃度1.5%、阿拉伯膠濃度0.5%、芯壁比1.0∶1.5、復(fù)凝聚反應(yīng)pH 3.8、攪拌速度450 r/min，在該條件下可制得包埋率達(dá)78.32%、粒徑分布均勻且平均粒徑在44.16 μm左右、流動(dòng)性好的球型固體微膠囊。 [結(jié)論]該研究制備的微膠囊符合實(shí)際應(yīng)用需求，為真菌殺蟲(chóng)劑的研制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 球孢白僵菌；明膠；阿拉伯膠；復(fù)凝聚法；微膠囊

中圖分類號(hào)S482.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）29-10179-04

基金項(xiàng)目“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD37B014）；黑龍江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（GA09B2033）。

作者簡(jiǎn)介李?yuàn)櫍?989-），女，吉林長(zhǎng)春人，碩士研究生，研究方向：有害昆蟲(chóng)綜合治理。* 通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事森林病蟲(chóng)害生物防治研究。

球孢白僵菌是目前世界上研究和應(yīng)用最多的昆蟲(chóng)病原真菌之一， 能侵染15個(gè)目149個(gè)科的700多種昆蟲(chóng)[1]，具有對(duì)人、畜及生態(tài)環(huán)境影響小、容易培養(yǎng)、致病性強(qiáng)、防治害蟲(chóng)效果好、保護(hù)害蟲(chóng)天敵、害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，已被用于防治多種農(nóng)林害蟲(chóng)[2]。但在實(shí)踐應(yīng)用中，無(wú)論是直接使用原菌粉、孢子粉或者使用白僵菌劑型， 對(duì)外界環(huán)境，如溫度、濕度、干旱、光照等，都較敏感。其中一個(gè)重要影響因素便是太陽(yáng)光中的紫外線對(duì)孢子的殺傷會(huì)降低微生物農(nóng)藥田間防治效果[3]。微膠囊劑具有保護(hù)芯材物質(zhì)免受環(huán)境影響的顯著特點(diǎn)，可有效防止或減弱紫外線的殺傷，從而提高殺蟲(chóng)效果，延長(zhǎng)殘效期。筆者以明膠和阿拉伯膠為壁材[4]，利用成囊技術(shù)包埋球孢白僵菌，制成微膠囊以提高菌體的穩(wěn)定性、增強(qiáng)其耐紫外照射、延長(zhǎng)儲(chǔ)存期，方便田間使用并延長(zhǎng)田間宿存能力。

微膠囊技術(shù)是以天然或合成的高分子材料作為囊壁，通過(guò)化學(xué)法、物理法或物理化學(xué)法將活性物質(zhì)囊心包裹起來(lái)，形成具有半透性或密封的囊膜的技術(shù)[5]。復(fù)凝聚法是物理化學(xué)法中相分離法的一種，它是根據(jù)天然高分子化合物在某一固定pH范圍內(nèi)呈相反電性的原理，使高分子天然化合物凝積在芯材表面，從而形成雙層壁的微膠囊[6]。微膠囊粒子的大小和形狀根據(jù)具體的制備工藝不同而存在較大范圍內(nèi)變化，通常制備的微膠囊粒子大小在1.00～1 000.00 μm，壁材的厚度在0.01～10.00 μm[7]。復(fù)凝聚法是制備微膠囊的重要方法之一，在國(guó)內(nèi)外已有廣泛的應(yīng)用和研究，主要用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、肥料等領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)，伊可兒等[8]生產(chǎn)的球孢白僵菌微膠囊劑在貯藏10個(gè)月后球孢白僵菌的孢子萌發(fā)率最高達(dá)80.28%；貯藏12個(gè)月后，對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)的校正死亡率仍達(dá)66%以上。陸繼鋒等[9]采用復(fù)凝聚法制備有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑辛硫磷微膠囊，增強(qiáng)了囊芯的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了殺蟲(chóng)劑的藥效。劉志強(qiáng)等[10]進(jìn)行球孢白僵菌聚合凝膠防治玉米螟（Ostrinia nubilalis）試驗(yàn)，施藥2個(gè)月后調(diào)查，仍有活性菌膠團(tuán)存在，殺蟲(chóng)效率達(dá)84%以上。馬麗杰等[11]和周小敏等[12]分別以殼聚糖和木質(zhì)素磺酸鈉、明膠和阿拉伯膠為囊材將阿維菌素包埋成微膠囊，包埋率均超過(guò)82%。在國(guó)外，復(fù)凝聚法制備的微膠囊劑也廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)。Gu等[13]以昆蟲(chóng)性信息素分子十二烷醇作為囊芯，采用復(fù)合凝聚法以明膠和阿拉伯膠作為囊壁材料制備昆蟲(chóng)性信息素微膠囊。Feng等[14]探討了利用復(fù)凝聚和噴霧干燥方法制成的香料微膠囊可抑制其揮發(fā)。Hussain等[15]利用復(fù)凝聚法，選用明膠和殼聚糖作為囊皮材料，制備花椒油微膠囊，改善花椒油微膠囊的緩釋效果。Light等[16]制備梨酯微膠囊防治蘋果蠹蛾幼蟲(chóng)，梨酯能吸引和誘捕蘋果蠹蛾幼蟲(chóng)，同殺蟲(chóng)劑協(xié)同作用能夠打亂寄主的位置并提高死亡率。目前，復(fù)凝聚法中最常見(jiàn)的壁材有明膠、阿拉伯膠、殼聚糖、木質(zhì)素磺酸鈉、海藻酸鈉等，筆者以明膠和阿拉伯膠為壁材[4]，探討了明膠濃度、阿拉伯膠濃度、芯壁材比、pH、反應(yīng)溫度和轉(zhuǎn)速等因素對(duì)復(fù)凝聚過(guò)程的影響，確定了球孢白僵菌微膠囊的制備體系，并表征了球孢白僵菌微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)，以期為開(kāi)發(fā)新型微生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種。球孢白僵菌（質(zhì)量 500億/g）由遼寧萬(wàn)恒生物制劑有限公司生產(chǎn)。 將菌粉過(guò)200目篩，裝瓶備用。

1.1.2試劑。明膠（SigmaAldrich公司）、阿拉伯膠（Amresco公司）、吐溫80（Amresco公司）、戊二醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）和冰乙酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），其余試劑購(gòu)自天津廣成化學(xué)試劑有限公司；去離了水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.1.3儀器。電子天平（AR2130，梅特勒-托利多儀器有限公司）、磁力攪拌器（德國(guó)SLK公司）、電動(dòng)攪拌器（德國(guó) CY1L6PSNCY1L6HAN）、高速離心機(jī)（D37520，德國(guó)Osterode公司）、電子掃描顯微鏡（JSM6460LV，日本JEOL公司）、激光粒度分析儀（BT9300H，遼寧丹東百特儀器有限公司）和生物顯微鏡（奧林巴斯有限公司上海分公司）。

1.2方法

1.2.1球孢白僵菌微膠囊的制備。把球孢白僵菌菌粉配成一定濃度的菌液，加入一定量20%吐溫80，置于磁力攪拌器以400 r/min攪拌乳化，制成球孢白僵菌懸浮液，鏡檢分散均勻后加入適量明膠水溶液，溫度緩慢升至40 ℃恒溫，待體系攪拌一段時(shí)間后，將其轉(zhuǎn)入等量的阿拉伯膠水溶液中，在不斷攪拌下緩慢滴加10%醋酸溶液于混合液中，調(diào)節(jié)系統(tǒng)的pH至4.0左右。繼續(xù)攪拌，將體系置于冰浴中使溫度降到5～10 ℃，加入固化劑戊二醛（25%） 溶液1 ml，再用10%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0～9.0，低溫下攪拌1 h后，取出微膠囊溶液進(jìn)行離心處理，用去離子水將離心管下方的微膠囊沉淀洗滌至無(wú)戊二醛，最后得到的微膠囊室溫晾干，干燥后的物質(zhì)為球孢白僵菌微膠囊粉末，4 ℃下保存。

1.2.2 球孢白僵菌微膠囊的形態(tài)特征觀察。將所制微膠囊懸浮液滴1滴到載玻片上，用光學(xué)顯微鏡觀察微膠囊的形態(tài)。在掃描電子顯微鏡樣品臺(tái)上貼一層雙面膠將微膠囊粉末輕輕撒在上面，輕輕吹去多余粉末，再進(jìn)行噴金處理，利用掃描電子顯微鏡對(duì)球孢白僵菌微膠囊干粉進(jìn)行電鏡掃描，觀察其外部形態(tài)特征。

1.2.3球孢白僵菌微膠囊包埋率的測(cè)定。取0.1 g菌粉配成菌懸液，測(cè)其菌數(shù)（B0），另取相同重量的菌粉所制微膠囊等體積溶液，測(cè)其菌數(shù)（B1），則包埋率=1 B1/B0[17]。

1.2.4粒徑檢測(cè)。采用BT2003型激光粒度分布儀進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次。

1.2.5單因素優(yōu)化微膠囊制備工藝。

1.2.5.1明膠濃度對(duì)微膠囊形成的影響。選取明膠濃度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，成囊pH3.8，反應(yīng)溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)結(jié)束后沉淀洗滌，測(cè)定包埋率，并在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)3次。

1.2.5.2阿拉伯膠濃度對(duì)微膠囊形成的影響。選取阿拉伯膠濃度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，明膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，成囊pH3.8，反應(yīng)溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)結(jié)束后洗滌沉淀，測(cè)定包埋率，并在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)3次。

1.2.5.3芯壁比對(duì)微膠囊形成的影響。芯壁比選取3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，成囊pH3.8，反應(yīng)溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)結(jié)束后洗滌沉淀，測(cè)定包埋率，并在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)3次。

1.2.5.4成囊pH對(duì)微膠囊形成的影響。pH選取3.4、3.6、3.8、4.0和4.2，明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，反應(yīng)溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)結(jié)束后洗滌沉淀，測(cè)定包埋率，并在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)3次。

1.2.5.5成囊溫度對(duì)微膠囊形成的影響。反應(yīng)溫度選取30、40、50、60和70 ℃，明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，成囊pH3.8，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)結(jié)束后洗滌沉淀，測(cè)定包埋率，并在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)3次。

1.2.5.6轉(zhuǎn)速對(duì)微膠囊形成的影響。轉(zhuǎn)速選取300、400、500、600和700 r/min，明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，成囊pH3.8，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)結(jié)束后洗滌沉淀，測(cè)定包埋率，并在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)3次。

1.2.6正交優(yōu)化微膠囊制備工藝。針對(duì)單因素影響因子的試驗(yàn)結(jié)果，比較其外部形態(tài)特征、微膠囊的包埋率，選出對(duì)微膠囊包埋率影響較大的因素，將該因素作為明膠/阿拉伯膠-球孢白僵菌微膠囊的正交試驗(yàn)的因素。將能夠影響試驗(yàn)結(jié)果的因素再次設(shè)置不同水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)以確定微膠囊的最佳制備工藝。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)均采用平均值表示，采用Excel 2003和正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 明膠濃度對(duì)微膠囊形成的影響。由圖1可知，微膠囊的包埋率隨明膠濃度的增大呈先升高后下降的趨勢(shì)，在明膠濃度為1.0%時(shí)包埋率達(dá)73.93%。0.5%～4.0%明膠制成的微膠囊包埋率分別為47.08%、73.93%、68.22%、49.42%和38.13%。由此得知，低濃度明膠溶液條件下制備出的微膠囊具有較高的包埋效率，低濃度有利于物質(zhì)的溶解，易分散在體系里，與阿拉伯膠反應(yīng)時(shí)能防止壁材過(guò)量而造成體系黏稠，但濃度太低也不利于微膠囊的形成，低濃度不能提供足夠的電荷與阿拉伯膠反應(yīng)。明膠濃度為1.0%和2.0%的微膠囊包埋率高于明膠濃度為0.5%、3.0%和4.0%的微膠囊。綜上所述，低濃度明膠的微膠囊可以提高包埋率；高濃度的明膠不利于復(fù)凝聚反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)造成囊壁致密，厚度增大，不利于囊芯的釋放，濃度繼續(xù)加大時(shí)，微膠囊之間還易出現(xiàn)粘連現(xiàn)象。因此，明膠的濃度應(yīng)控制在0.5%～2.0%范圍內(nèi)。

2.1.2 阿拉伯膠濃度對(duì)微膠囊形成的影響。由圖2可知，阿拉伯膠濃度在0.5%～4.0%時(shí)制成的微膠囊包埋率分別為66.42%、73.93%、70.95%、56.40%和46.82%。隨阿拉伯膠濃度的增大球孢白僵菌微膠囊的包埋率表現(xiàn)為先增大后減小，在濃度為1.0%時(shí)包埋率最大。由此得知，阿拉伯膠濃度為0.5%、1.0%和2.0%所制微膠囊的包埋率高于阿拉伯膠濃度為3.0%和4.0%的微膠囊，阿拉伯膠濃度為3.0%和4.0%時(shí)，溶液黏度增大易粘連。綜上所述，阿拉伯膠濃度為0.5%～2.0%時(shí)有利于微膠囊形成。

2.1.3 芯壁比對(duì)微膠囊形成的影響。由圖3可知，隨芯壁比的增大，包埋率呈先升高后降低的趨勢(shì)，芯壁比為1∶2時(shí)微膠囊的包埋率最大為73.93%。芯壁比為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1時(shí)制成的微膠囊包埋率分別為51.94%、73.93%、69.21%、52.93%和26.07%。由此得知，芯壁比為1∶1和1∶2的微膠囊的包埋率高于芯壁比為3∶1、2∶1和1∶3的微膠囊。芯壁比過(guò)大，芯材過(guò)量會(huì)導(dǎo)致包埋率下降，壁材過(guò)少不能完全將芯材包覆，使得大量的囊芯粘在微膠囊表面，囊壁膜變薄。芯壁比過(guò)小，囊壁材料有大量剩余，囊壁濃度過(guò)大也易粘連，形成的囊壁變厚，不利于囊芯的釋放。

2.1.4 pH對(duì)微膠囊形成的影響。由圖4可知，在pH為3.4～4.2時(shí)制成的微膠囊包埋率分別為58.02%、66.49%、73.93%、74.45%和64.40%。pH為4.0時(shí)微膠囊的包埋率最大為74.45%。pH為3.8和4.0的微膠囊包埋率高于pH為3.4、3.6和4.2的微膠囊，這是由明膠和阿拉伯膠的性質(zhì)所決定的，在水溶液中明膠分子中的正負(fù)電荷數(shù)量受介質(zhì)pH的直接影響。當(dāng)pH為3.6～4.2時(shí)明膠中正電荷達(dá)最大，在該條件下加入帶負(fù)電荷的阿拉伯膠溶液，此時(shí)彼此的靜電作用處于最理想狀態(tài)，明膠和阿拉伯膠產(chǎn)生凝聚現(xiàn)象而形成微膠囊[7]。當(dāng)pH小于3.0時(shí)，也不能得到聚合物，這是因?yàn)樵谳^強(qiáng)酸性條件下，縮聚生成的微膠囊易分解為小分子。

2.1.5 溫度對(duì)微膠囊形成的影響。由圖5可知，反應(yīng)溫度在30～70 ℃時(shí)制成的微膠囊的包埋率分別為38.13%、73.93%、50.11%、35.19%和29.17%。由此得知，40和50 ℃微膠囊的包埋率高于反應(yīng)溫度為30、60和70 ℃的微膠囊，反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)包埋率最高為73.93%。綜上所述，反應(yīng)溫度為40 ℃左右時(shí)有利于微膠囊形成。

2.1.6 轉(zhuǎn)速對(duì)微膠囊形成的影響。由圖6可知，微膠囊的包埋率隨轉(zhuǎn)速的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)速為500 r/min時(shí)制成的微膠囊的包埋率最大為73.93%。轉(zhuǎn)速為300～700 r/min時(shí)制成的微膠囊包埋率分別為44.49%、66.28%、73.93%、64.33%和39.51%。由此得知，攪拌速度為400和500 r/min條件下制備的微膠囊的包埋率高于攪拌速度為300、600和700 r/min條件下制備的微膠囊。表明低轉(zhuǎn)速有利于復(fù)凝聚反應(yīng)的進(jìn)行，高轉(zhuǎn)速易使反應(yīng)體系紊亂，阻礙復(fù)凝聚反應(yīng)的發(fā)生。因此，將攪拌速度控制在低轉(zhuǎn)速下即可保證反應(yīng)的正常進(jìn)行。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選出影響微膠囊形成的主要條件，包括明膠濃度、阿拉伯膠濃度、芯壁比、成囊pH和轉(zhuǎn)速5個(gè)因素（表1），以微膠囊包埋率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)。由表2可知，影響包埋率的各因素主次順序?yàn)锳、C、B、D、E，即明膠濃度的影響最大，其次是芯壁比，阿拉伯膠濃度、pH和轉(zhuǎn)速對(duì)包埋效果的影響都較小，最佳組合為A3C3B1D2E2，即最佳包埋工藝條件為明膠濃度1.5%、阿拉伯膠濃度0.5%、芯壁比1.0∶1.5、pH3.8、轉(zhuǎn)速450 r/min。并以上述條件制備球孢白僵菌微膠囊。

2.3球孢白僵菌微膠囊的形態(tài)特征利用光學(xué)顯微鏡與掃描電子顯微鏡對(duì)最優(yōu)條件下制備的球孢白僵菌微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)和整體分布進(jìn)行表征。由圖7可知，在水分散體系中，球孢白僵菌微膠囊呈球形，單分散性好，形態(tài)規(guī)則，大小較均勻。由圖8可知，球孢白僵菌微膠囊表面光滑完整，成囊性及密封性良好，雜質(zhì)較少。