【摘要】目的：研究肉桂醛與鹽酸小檗堿單獨使用，以及聯(lián)合氟康唑抗白念球菌的作用影響與機制。方法：采取體外藥物敏感試驗方法，檢測肉桂醛與鹽酸小檗堿單獨使用以及聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钋蚓目咕钚?；凝膠分析軟件分析其藥物對白念球菌PLB1基因的mRNA表達影響【1】。結果：肉桂醛與鹽酸小檗堿單獨使用時，其對白念球菌具有明顯的抑制生長作用；聯(lián)合氯康唑作用時，均具有協(xié)同作用；藥物處理的白念球菌PLB1的mRNA表達水平有明顯差異，聯(lián)合使用時比單獨使用時其表達水平明顯降低。結論：肉桂醛、鹽酸小檗堿與氯康唑都具有明顯的抗白念球菌作用，當藥物聯(lián)合時，白念球菌的PLB1基因mRNA的相對表達量明顯低于藥物單獨使用

【關鍵詞】體外實驗；肉桂醛；鹽酸小檗堿；氯康唑；白念球菌

【中圖分類號】R-0 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2014）02-0332-02

近些年，隨著抗菌藥物和激素在臨床上的大量應用，真菌感染率持續(xù)升高，其中白念球菌是院內(nèi)感染的主要致病菌之一【2】。氟康唑是目前國內(nèi)治療白念球菌感染的常用藥物，由于在臨床上長期的應用，耐藥菌株不斷產(chǎn)生，白念球菌對氟康唑的耐藥問題日漸凸顯【3】。研究表明，中藥中大量結構新穎、藥理活性強的化合物，在抗真菌感染中具有一定優(yōu)勢。目前，聯(lián)合應用抗菌藥物來避免耐藥性產(chǎn)生的減少藥物副作用是治療真菌感染的研究方向之一。本次研究將通過探討肉桂醛、鹽酸小檗堿和氯康唑單獨及聯(lián)合抗白念球菌的作用及機制，為臨床上應用中藥及中、西藥物聯(lián)合治療白念球菌感染提供初步試驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥液配制

1.2 菌液配置

取-800C凍存的白念球菌ATCC10231菌種100μL菌液，滴于SDA培養(yǎng)基上，用涂玻棒，將菌液均勻鋪于培養(yǎng)基。370C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)10min后，將培養(yǎng)皿倒置并繼續(xù)培養(yǎng)24h。連續(xù)畫線接種于新培養(yǎng)基上，370C培養(yǎng)24h。直徑>1mm的菌液（5個單菌落）置于生理鹽水中，用RP-MI1640培養(yǎng)基稀釋菌濃度：5×104CFU/mL。

1.3 3 種藥物的藥敏試驗

參照美國臨床與實驗標準協(xié)會的真菌藥物敏感性試驗方案的微量稀釋法步驟操作：將肉桂醛、鹽酸小檗堿、氯康唑分別用RP-MI1640培養(yǎng)基倍比稀釋。加入96孔板中，每孔100μL藥液+100μL含菌培養(yǎng)液。同時設立對照組。每次實驗，均設立一組質(zhì)控菌。經(jīng)370C培養(yǎng)48h，觀察結果。每組設3個復孔，試驗重復5次。

1.4 聯(lián)合藥敏試驗

采用棋盤微量稀釋法檢測，在96孔板上，將肉桂醛、鹽酸小檗堿、氟康唑藥物原液分別用RPMI1640培養(yǎng)基倍比稀釋，使肉桂醛、鹽酸小檗堿、氟康唑的終濃度為單用時測得該種菌株MIC值的1/8、1/4、1/2、1、2、4倍濃度。按照棋盤格法的設計方式，以縱、橫兩個方向。將不同濃度的兩種聯(lián)合藥物各50μL加入96孔板中，每孔再加入100μL配制好的菌懸液，分別混合后進行藥物聯(lián)合作用。同時設陽性對照孔及陰性對照孔，混勻。真菌培養(yǎng)步驟和藥理處理時間同上。

1.5 3種藥物的單獨及聯(lián)合對白念球菌PLB1mRNA表達水平的影響

試驗設對照組、試驗組，經(jīng)370C培養(yǎng)6～8h后，按照RNApure Yeast Kit酵母RNA提取試劑盒操作方法，提取各組總RNA，測定總RNA濃度和純度，在紫外透射儀上觀察，并掃描凝膠，檢測總RNA的完整性，進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應。采用凝膠分析軟件對電泳結果分析，得到內(nèi)參TFF3、目的基因PLB1的灰度值，目的基因mRNA的相對表達量用目的基因與內(nèi)參基因條帶的灰度值的比值來表示。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 藥物單獨及其聯(lián)合抗白念球菌藥敏實驗的結果

藥物單獨作用于白念球菌時：肉桂醛、鹽酸小檗堿、氯康唑抗白念球菌的MIC范圍分別為160～320、80～160和8～16μg/mL，其MIC80分別為：320、80、16μg/mL；藥物兩兩聯(lián)合作用于白念球菌時，單藥MIC值得幾何均數(shù)均顯著減少（見表1）。

表1 藥物聯(lián)合抗白念球菌作用效果評價

2.2 藥物對白念球菌相關PLB1基因mRNA表達的影響

通過RT-PCR技術，得到內(nèi)參基因TEF3和PLB1擴增產(chǎn)物分別呈517bp和416bp條帶。其PLB1基因在mRNA的相對表達量水平。

3 討論

本研究通過肉桂醛、鹽酸小檗堿單獨及聯(lián)合氟康唑作用白念球菌，對白念球菌PLB1的表達水平進行分析，檢測結果顯示：肉桂醛、鹽酸小檗堿單獨抗菌時，均可降低白念球菌酶基因PLB1mRNA的表達量，引起細胞外PL的分泌量降低，當分別與氟康唑聯(lián)合時，其白念球菌酶基因PLB1mRNA的表達量要明顯低于藥物單用。由于肉桂醛和鹽酸小檗堿是中藥中的天然活性成分，植物資源豐富，且在長期臨床應用中少見不良反應和毒副作用。因此，肉桂醛、鹽酸小檗堿聯(lián)合氟康唑聯(lián)合應用的協(xié)同作用為今后抗真菌治療提供了新的思路。

參考文獻：

[1]譚心，王和，苑天紅，馬妍.肉桂醛與鹽酸小檗堿聯(lián)合氟康唑抗白念球菌作用的體外實驗觀察[J].遵義醫(yī)學院學報，2013，36（3）：221-224.

[2]劉奇，白麗.白念球菌磷酸酯酶B的研究進展[J].中國熱帶醫(yī)學，2008，8（13）：1050-1052.

[3]唐冰，朱家源等.187株深部感染真菌的菌群分布及耐藥性分析[J].中國熱帶醫(yī)學，2007，7（3）：407-424.