【摘要】目的 檢測原發(fā)性肝癌病人與正常人PON1基因的多態(tài)性。方法 對121例原發(fā)性肝癌病人和100正常人運用SnapShot 技術(shù)檢測PON1基因（rs854552、rs662、rs757158、、rs854573、rs705382）這5個位點的表達(dá)。結(jié)果 原發(fā)性肝癌病人與正常人的PON1基因（rs854552、rs662、rs757158、、rs854573、rs705382）這5位點的表達(dá)P>0.05.結(jié)論 PON1基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌無一定的相關(guān)性

【中圖分類號】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1671-8801（2014）02-0107-02

原發(fā)性肝癌（HCC，以下簡稱肝癌）是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率逐年增長，已超過65萬/年， 居于惡性腫瘤的第5位； 死亡接近62.3萬/年，位居腫瘤相關(guān)死亡的第3位。HCC在我國高發(fā)，目前，我國發(fā)病人數(shù)約占全球的56%；在腫瘤相關(guān)死亡中僅次于肺癌，位居第二。因此，肝癌嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命.目前已證實PON1基因M和Q等位基因的出現(xiàn)頻率和乳腺癌發(fā)病風(fēng)險呈正相關(guān)，同時表現(xiàn)為MM型和QQ型基因的個體更易誘發(fā)乳腺癌（參考文獻(xiàn)1）、另有實驗證明檢測血清PONI的活性可以作為肺癌患者與前列腺癌患者的輔助檢查項目之一（參考文獻(xiàn)6）、也有報道顯示PON1基因與2型糖尿病的發(fā)生有關(guān)（參考文獻(xiàn)7）。而關(guān)于肝癌的研究甚少，本實驗運用SnapShot 技術(shù)深入研究PON1基因多態(tài)性（rs854552、rs662、rs757158、、rs854573、rs705382）與原發(fā)性肝癌發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實驗選取 2008 年至2012 年在浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽胰中心住院的手術(shù)患者，經(jīng)實驗室及影像學(xué)等檢查，臨床診斷為原發(fā)性肝癌，行原發(fā)性肝癌根治手術(shù)，所有患者皆經(jīng)術(shù)后病理明確診斷為肝細(xì)胞癌，121例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌病人的外周血標(biāo)本，其中男性73 名，女性48名，年齡28歲至71歲，平均45.3歲，HBsAg陽性115例，陰性6例；AFP陽性87例，陰性34例。對照組100例均來自2010年3月～2012年4月間，在浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院采集的體檢正常人靜脈血樣。體檢結(jié)果均正常，無肝硬化、乙肝相關(guān)病史、糖尿病等疾病，且一級親屬無HCC病史。其中男性56 名，女性44名，年齡21歲至69歲，平均39.4歲，HBsAg，AFP均陰性。研究對象均有完整的臨床資料，均簽署知情同意書。

1.2 DNA提取

運用Promega maxwell@16機器提取DNA，大約40 分鐘后，提取DNA 程序完成。將收集管中大約210μl 的DNA 溶液轉(zhuǎn)移至凍存管。凍存管在-80℃冰箱保存

1.3 PON1基因的多態(tài)性分析

運用SnapShot 技術(shù)進(jìn)行PON1基因的多態(tài)性分析。

1.3.1 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)體系：（20μl）包含1x HotStarTaq buffer， 3.0 mM Mg2+， 0.3 mM dNTP， 1 U HotStarTaq polymerase （Qiagen Inc.） 和 1 μl 樣本DNA。 反應(yīng)條件：95oC 2min； 11 cycles x （94oC 20s， 65oC-0.5oC /cycle 40 s， 72 oC 1min30s）； 24cycles x （94oC 20s， 59oC 30s， 72 oC 1min30s）； 72oC 2 min； 4 oC for ever

1.3.2 PCR產(chǎn)物純化 在15μl PCR產(chǎn)物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 oC溫浴1小時， 然后75oC滅活15分鐘

1.3.3 SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)

1.3.4 延伸產(chǎn)物上ABI3730XL測序儀 取0.5μl 純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5μl Liz120 SIZE STANDARD， 9μl Hi-Di 混勻， 95 oC變性5分鐘后上ABI3730XL測序儀，收集的原始數(shù)據(jù)用 GeneMapper 4.1 （AppliedBiosystems Co.， Ltd.， USA） 來分析。

1.4 結(jié)果

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)顯示PON1基因多態(tài)性（rs854552、rs662、rs757158、rs854573、rs705382），他們的位點等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。經(jīng)這些位點的共性，特性分層后分析差異扔無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）（表2）（表3）（表4）（表5）

1.5 討論

對氧磷脂酶（paraoxonase，PON）是一類芳香酯酶，它能催化磷酸脂鍵水解，降解有機磷酸芳香羧基脂及氨基甲酸脂等。PON基因家族至少有3個成員即PON1、PON2、PON3，PON1基因位于人類第7號染色體短臂7q21-22，含9個外顯子和8個內(nèi)含子，具有多種多態(tài)性。目前發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)PON1活性與動脈粥樣硬化、肝臟炎性疾病在內(nèi)的很多疾病密切相關(guān)。血清PON1活性的降低數(shù)值可作為慢性肝炎和肝硬化患者肝臟損傷程度的指征。實驗證明，體內(nèi)PON1通過與HDL結(jié)合發(fā)揮強大的抗氧化功能，通過降低肝組織的氧化壓力，阻止肝臟脂質(zhì)過氧化等機制緩解肝臟纖維化的進(jìn)程，降低肝損傷的程度（參考文獻(xiàn)2）。

目前已有文獻(xiàn)報道PON1基因，M和Q等位基因的出現(xiàn)頻率和乳腺癌發(fā)病風(fēng)險呈正相關(guān)，對于PON1基因，M和Q等位基因的出現(xiàn)頻率和乳腺癌發(fā)病風(fēng)險呈正相關(guān)，同時表現(xiàn)為MM型和QQ型基因的個體更易誘發(fā)乳腺癌。另有實驗證明原發(fā)性肺癌患者血清中PON1活性顯著降低 其靈敏度和特異性符合一般檢驗的要求，因此檢測血清PONI的活性可以作為肺癌患者與前列腺癌患者的輔助檢查項目之一，也有報道顯示PON1基因與2型糖尿病的發(fā)生有關(guān)，而已經(jīng)有報道證實2型糖尿病是原發(fā)性肝癌的獨立危險因素之一，因此本次研究希望檢測PON1基因的多態(tài)性（rs854552、rs662、rs757158、rs854573、rs705382）發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性肝癌發(fā)生的相關(guān)性。

本研究尚未發(fā)現(xiàn)PON1基因多態(tài)性（rs854552、rs662、rs757158、rs854573、rs705382）與HCC發(fā)病有顯著相關(guān)性，其中一個可能原因在于目前收集的病例數(shù)量偏少。由于實驗中對照組基因頻率的高低會直接影響最終統(tǒng)計學(xué)結(jié)果的判斷，若對照組的基因頻率低，則更加容易得到陽性結(jié)果?，F(xiàn)階段實驗對照的病例數(shù)量偏少，可能會使預(yù)期實驗?zāi)繕?biāo)產(chǎn)生一定的偏離。另一原因可能是沒有檢測PON1基因多態(tài)性全部的位點，以致一些可以與原發(fā)性肝癌相關(guān)的位點遺漏。所以今后在該課題的進(jìn)一步研究中，不僅需要擴大樣本的數(shù)量，還應(yīng)該檢測基因多態(tài)性的全部位點，從而使實驗結(jié)果盡可能達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。本研究的實驗結(jié)果對于進(jìn)一步研究肝癌發(fā)生的相關(guān)性有一定的參考意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳云，.PON1基因多態(tài)性和乳腺癌風(fēng)險相關(guān)性的Meta分析[J]. 現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)2012，24（10）10.3969/j.issn. 1671-

0800.2012.10.021

[2]騰霞.孫曼霽. 對氧磷酶研究進(jìn)展[J]生命科學(xué)，2002，（2）107-111.doi：10.3969/j.issn.1004-0374.2002.02.012

[3]楊玉梅.吳江. 對氧磷脂酶1基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究[J]中國臨床神經(jīng)科學(xué)2010，18（3）10.3969/j.issn.1008-0678.2010.03.013

[4]魏力強.劉萬里. 血清對氧磷酯酶-1活性與肝硬化Child-Pugh分級的關(guān)系[J]現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志2008，23（3）10.3969/j.issn.1671-7414.2008.03.004

[5]張鵬.李慧敏. PON1基因微衛(wèi)星多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）2006，26（11）10.3969/j.issn.1007-4368.2006.11.013

[6]梁紅. 肺癌患者血清中對氧磷酶1活性的初步研究[J].山西醫(yī)藥雜志2010，39（6）10.3969/j.issn.0253-9926.2010.06.003

[7]季尚瑋.王江濱. 2型糖尿病對原發(fā)性肝癌發(fā)病的危險性分析[J]肝臟 2007，12（3）10.3969/j.issn.1008-1704.2007. 03.

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