中圖分類號(hào)：S851.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2014）03-0032-02

摘 要：本研究參照美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（EPA）關(guān)于消毒劑在干燥的非生物表面的抗病毒效果測(cè)評(píng)方法，評(píng)定美國(guó)陶氏化學(xué)公司的格利特消毒劑GLUTEX GS2對(duì)禽呼腸病毒的殺毒效力。結(jié)果表明：經(jīng)合成硬水1：256倍稀釋的格利特消毒劑GLUTEX GS2，在與干燥處理的禽呼腸病毒膜充分接觸10 min后，病毒活性低于1.5個(gè)滴度，表明此消毒劑對(duì)禽呼腸病毒具有殺滅效力，可用于此病毒的日常消毒中。

關(guān)鍵詞：禽呼腸病毒；抗病毒效果；評(píng)測(cè)；GLUTEX GS2消毒劑

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

本測(cè)試旨在測(cè)評(píng)陶氏化學(xué)公司格利特消毒劑GLUTEX GS2的抗病毒效力。其方法是用稀釋的消毒劑產(chǎn)品液處理被病毒附著污染的物體表面后，測(cè)定回收病毒的侵染性，根據(jù)病毒侵染性的降低程度來(lái)表征消毒劑的抗病毒能力。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 測(cè)試病毒

試驗(yàn)所用禽呼腸病毒（UConn 1133株）來(lái)自位于美國(guó)斯托斯巴克斯特路67號(hào)的斯帕法斯公司（SPAFAS）。該病毒懸浮液是組織培養(yǎng)基。

2.2 細(xì)胞組織培養(yǎng)液和培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用原代雞胚成纖維細(xì)胞來(lái)自位于美國(guó)斯托斯巴克斯特路67號(hào)的斯帕法斯公司（SPAFAS）。細(xì)胞培養(yǎng)物在添加了10 %（V/V）牛胎兒血清（在56 ℃ 熱滅活30 min）、100 單位/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、50 μg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性毒素B和25 mM四羥乙基哌嗪乙磺酸的最低必需培養(yǎng)基（Minimal Essential Medium，MEM）中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)后置于37 ℃含 5 % CO2的潮濕空氣下的一次性實(shí)驗(yàn)定器皿中，制成單層組織培養(yǎng)物。培養(yǎng)物感染病毒后，置于裝有相同成分但添加了2 %血清的維持培養(yǎng)基中。

2.3 試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）采用Dulbecco和Vogt的方法配制（實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志[J]. 1954， Vol.99：167-182）。合成硬水在使用當(dāng)天配制，配制方法參照 AOAC 4.024法（美國(guó)[美國(guó)公職分析化學(xué)工作者協(xié)會(huì)（AOAC），第14版，1984，第70～71頁(yè)）。

2.4 消毒劑的制備

每份消毒劑在使用當(dāng)天按照1∶256的比例用 1 200 mg/kg AOAC合成硬水進(jìn)行稀釋。

2.5 病毒膜的制備

病毒膜通過將0.2 mL的病毒懸浮液涂復(fù)在滅菌的皮氏玻璃培養(yǎng)皿底部制作而成。隨后置于室溫（約23 ℃）及環(huán)境濕度下，避免直接光照直至明顯干燥（約45～75 min）。

2.6 用消毒劑處理病毒薄膜

干燥的病毒薄膜在約23 ℃下用2.0 mL消毒劑稀釋液（噴霧）處理，使兩者保持10 min的充分接觸。在接觸一定時(shí)間后，用橡膠淀帚刮下培養(yǎng)皿底部物質(zhì)，并立即取一小份病毒-消毒劑混合物加入交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）凝膠過濾柱中，用凝膠過濾法將病毒從消毒劑中分離出。

2.7 病毒對(duì)照薄膜的處理

用消毒劑處理一份病毒薄膜后，另一份相同病毒薄膜再次懸浮在2 mL的磷酸鹽緩沖生理鹽水中，隨后取一小份混合液加入交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）過濾柱中。

2.8 交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾（Sephadex Gel Filtration）

交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾按照Blackwell和Chen的改良方法[美國(guó)公職分析化學(xué)工作者協(xié)會(huì)雜志53期（1970年）第1229～1236頁(yè)]進(jìn)行操作。3 cc交聯(lián)葡聚糖柱（LH-60-120）利用磷酸鹽緩沖生理鹽水保持平衡，離心清除液體中的空隙體積，隨后裝入約0.6 mL病毒-消毒劑混合液或病毒-磷酸鹽緩沖對(duì)照混合液，并再次離心。

2.9 病毒回收分析

對(duì)每份病毒-消毒劑和對(duì)照病毒濾出液進(jìn)行稀釋，接種至細(xì)胞培養(yǎng)液中。每次稀釋至少使用4份培養(yǎng)液。單層細(xì)胞接種0.05 mL稀釋液，并在37 ℃下培養(yǎng)1 h。干燥后，加入維持培養(yǎng)基（0.2 mL），并在恒溫37 ℃下接種培養(yǎng)液。接種7 d后，記錄培養(yǎng)液細(xì)胞病變效應(yīng)。細(xì)胞病變效應(yīng)最終結(jié)果見表1。

2.10細(xì)胞毒性對(duì)照

每份已稀釋消毒劑通過交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾，利用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，隨后接種于添加病毒消毒劑混合液的細(xì)胞培養(yǎng)液中。接種后7 d后，記錄細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞毒性。

2.11 計(jì)算方法

采用Reed-Muench法（L. J. Reed和H. Muench. 美國(guó)衛(wèi)生醫(yī)學(xué)雜志[J].1938，Vol.27：493-497），計(jì)算以50 %侵染性的log10（TCID50）和毒性（TD50），以表示病毒效價(jià)及細(xì)胞毒性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

格利特消毒劑GLUTEX GS2對(duì)禽呼腸病毒的病毒感染性和細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果見表1。

4 結(jié)論

陶氏化學(xué)公司格利特消毒劑GLUTEX GS2在測(cè)試條件下，能有效殺滅禽呼腸病毒。