摘要：

丙型肝炎病毒（HCV）是引起丙型肝炎的病原體。HCV感染是一個世界性的健康問題，其發(fā)病率逐年增高，且致病性強(qiáng)，較易轉(zhuǎn)為墁性，甚至發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌。進(jìn)一步深入HCV生物學(xué)特性，尤其是基因分型的研究，對于丙型肝炎嚴(yán)重程度的評估；抗病毒藥物敏感性的預(yù)測；提高診斷準(zhǔn)確率以及疫苗研制和傳播的地域分布特征的認(rèn)識均有較大意義。

關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒；基因分型；意義

【中圖分類號】

R322.4+7 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）08-0025-01

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）是引起丙型肝炎的病原體，最初于1975年在一名輸血后的患者血清中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時命名為非A非B型肝炎病毒（Non-A Non-B Hepatitis，NANBH）^[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，Michael Houghton的團(tuán)隊在1989年首次克隆其基因組^[2]。同年Alter HJ等人在NANBH患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分析了其抗體^[3]，其隨后旋即被命名為HCV。HCV感染是一個世界性的健康問題^[4]，其發(fā)病率逐年增高，且致病性強(qiáng)，較易轉(zhuǎn)為慢性，導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，并可發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）。HCV主要由血液系統(tǒng)傳播，據(jù)估計全球的HCV感染率約為3.0%，即大約有1.7億人被感染，每年新發(fā)病例約3.5萬例^[6]。在我國，HCV的感染率約在2.5%～4.9%之間，有超過5000萬人感染HCV。HCV感染者初期大多數(shù)無明顯癥狀，大約有70%～80%的HCV急性感染會轉(zhuǎn)為慢性感染，其中約有10%～20%的慢性感染者會轉(zhuǎn)變成肝硬化，最終約有5%的慢性感染者進(jìn)展為HCC^[7]。

深入研究HCV基因分型，對于反映丙型肝炎疾病的嚴(yán)重程度；抗病毒藥物敏感性的預(yù)測；輔助提高丙型肝炎的診斷準(zhǔn)確率；以及HCV疫苗的研究和了解HCV傳播的地域分布特征均有較大意義。

1 HCV分型方法

1.1 全基因組直接測序分析法：此方法是目前HCV基因分型方法中最經(jīng)典、最準(zhǔn)確的方法。該方法采用比較特異性多PCR引物擴(kuò)增特定的核苷酸序列區(qū)域，直接測序后與GenBank中己上傳的HCV序列進(jìn)行比對后，描繪出系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)進(jìn)化距離及種系關(guān)系確定HCV的基因型。直接測序法可以最大程度的獲得HCV的序列信息，結(jié)果最為可靠，是HCV基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但此法耗時、費(fèi)力且昂貴，并不適合所有的實驗室使用。

1.2 型特異性引物擴(kuò)增法（PCR Amplification with Sequence Specific Primers，PCR-SSP）：根據(jù)HCV不同基因型在某一特定區(qū)段（主要是C區(qū)和NS5B區(qū)）堿基序列上的差異，設(shè)計一系列型特異性引物，不同HCV基因型可通過PCR擴(kuò)增出長度大小不同的片段，并以此分型。因為該方法相對簡便易操作，曾是國內(nèi)外學(xué)者較早普遍使用的方法。其中最先應(yīng)用的Okamoto法是日本學(xué)者Okamoto根據(jù)C區(qū)的基因序列變化的規(guī)律性與HCV基因型的關(guān)系建立的。該方法的主要缺點是必須要保證HCV各型之間有較大差異，且對PCR引物的設(shè)計要求較高，每份樣品需同時進(jìn)行多次檢測才能最終確定基因型，所以其準(zhǔn)確性及靈敏度都較低。雖然該方法經(jīng)改進(jìn)后靈敏度及準(zhǔn)確性都有所提高，但與相對于其他分型方法，分型的效果仍較差。因此未能在臨床及科研中廣泛應(yīng)用。

1.3 限制性片段長度多態(tài)性分析法（Restrietion Fragment Length polymer- phism，RELP）：根據(jù)HCV不同基因型在某一區(qū)段個別核苷酸序列的變異直接導(dǎo)致某些酶切位點的改變，PCR擴(kuò)增靶基因后，用多種特定的種限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不同的基因型或亞型就可以得到長度大小不同的酶切片段。然后，根據(jù)酶切后電泳所表現(xiàn)的片段大小及多態(tài)性進(jìn)行HCV基因分型。一般選擇5’UTR或NS5B區(qū)域作為RELP分型的靶區(qū)域。該方法具有快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，但其缺點是僅用少數(shù)幾個內(nèi)切酶，檢測基因型別有限，最重要的是不能發(fā)現(xiàn)新的基因型。

1.4 型特異性核酸探針雜交法（PCR Sequence Specific Oligonueleotide，PCR-SSO）：根據(jù)各型HCV某一區(qū)段的序列差異分別設(shè)計特異探針并固定在纖維素膜或芯片上，通過生物素或者其它類型的標(biāo)記物標(biāo)記引物，利用RT-PCR擴(kuò)增HCV基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物與膜上特異性探針雜交，經(jīng)顯色反應(yīng)后，檢測HCV基因型。目前國內(nèi)外廣泛使用的線性探針雜交（Line Probe Assay，LiPA）就是型特異性核酸探針雜交分型方法。該方法操作比較簡便，而且改良后的LiPA-II對HCV 1a、lb亞型及東南亞地區(qū)的6型的鑒別有較好的特異性。但是，該方法價格昂貴，不適宜所有的實驗室廣泛推廣。

HCV RNA基因組由多個區(qū)段組成，選擇哪個區(qū)段作為分型依據(jù)成為關(guān)鍵問題。5’UTR區(qū)域的序列是整個HCV基因組中最為保守的部分，種系間變化的程度及進(jìn)化頻率都很低，可用于區(qū)分主要基因型?，F(xiàn)今市面上幾乎所有商品化的HCV基因分型試劑盒，如LiPA、TRUGENE、Invader、Abbott等都是基于此區(qū)域設(shè)計的。但在我國西南地區(qū)及東南亞，部分6型和la、lb亞型在該區(qū)域序列幾乎完全一致，所以還需要配合其它區(qū)域序列分析進(jìn)行詳細(xì)區(qū)分。NS5B區(qū)和C/El區(qū)進(jìn)化變異較大，屬于HCV的亞基因區(qū)及種屬信息區(qū)，富含區(qū)分HCV基因型及亞型的序列信息。1993年，Simmond等選擇NS5B作為主分型區(qū)域，利用核苷酸序列測序及系統(tǒng)進(jìn)化分析，最終確立為國際通用的HCV分型命名，即將HCV分為6種主要基因型及一系列亞型。但是，由于種屬信息區(qū)序列具有較高的異質(zhì)性，由于引物結(jié)合失敗而導(dǎo)致的PCR擴(kuò)增失敗的幾率也隨之增加。因此，聯(lián)合兩個以上的區(qū)域如5’UTR與C區(qū)、El與NSSB區(qū)或El與C區(qū)對HCV基因進(jìn)行分型，則可使分析結(jié)果更加可信和真實。雖然測定部分區(qū)域也可以進(jìn)行HCV分型，但是測定全基因組序列才是最可靠的方法。

2 HCV基因分型的意義

2.1 反映疾病的嚴(yán)重程度：

血清HCV RNA水平與肝臟的炎癥活動有明顯相關(guān)性。HCV RNA載量變化反映了病毒復(fù)制的活躍程度和病情的進(jìn)展情況。HCV基因型與HCV RNA含量有著明顯的相關(guān)性，HCV基因1、2型感染者血清中HCV RNA含量顯著高于HCV基因3型感染者，且病毒復(fù)制活躍，病情較易轉(zhuǎn)為慢性化。不同的HCV基因型所致疾病的嚴(yán)重程度也有所不同，某些基因型可能會引起較嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷。血清轉(zhuǎn)氨酶檢測是一項評估肝病活動性的有效的生化指標(biāo)。HCV基因型2感染和HCV基因2/3混合型感染很可能導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)氨酶異常升高。

2.2 抗病毒藥物敏感性預(yù)測指標(biāo)：

α干擾素（IFN-α）是丙型肝炎抗病毒治療的首選藥物，在其臨床應(yīng)用過程中，研究發(fā)現(xiàn)IFN-α的臨床療效與HCV基因型有密切關(guān)系，病毒基因型可以作為預(yù)測α干擾素治療丙型肝炎臨床療效的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為，1b型感染者血清中病毒含量高、病毒復(fù)制活躍，對干擾素反應(yīng)差，臨床療效低于2a、2b和3型?，F(xiàn)今，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為干擾素對HCV基因3型療效較HCV基因2型好。已有的研究表明HCV基因型1、4、5、6和2、3對α干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（SVR）分別為30%和65%，感染1b亞型的患者對干擾素治療效果最差。這可能是由于NS5A區(qū)域內(nèi)ISDR基因突變，引起干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒關(guān)鍵通路PKR途徑變化所致。

2.3 輔助提高丙型肝炎的診斷準(zhǔn)確率：

目前臨床上普遍使用的第三代抗體檢測HCV方法，抗原幾乎都來自la亞型重組蛋白，HCV la亞型感染者的血清抗體效價明顯高于其他基因型或者亞型感染者。但是不同基因型的HCV核苷酸序列之間的有比較大的差異，因此所表達(dá)出蛋白的免疫原性和抗原性也有所區(qū)別。為了提高對HCV感染的檢測靈敏度，應(yīng)根據(jù)本地區(qū)的HCV流行特點來選擇診斷試劑和方法，以提高診斷敏感性和特異性。應(yīng)該選擇不同基因型的最保守區(qū)域作為檢測靶位點，以保證最大限度的檢出病毒，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果，為臨床輸血的安全性提供可靠保障。

2.4有助于HCV疫苗的研究：

預(yù)防丙型肝炎的最有效的措施應(yīng)該是HCV疫苗。但是由于HCV基因的突變率非常高，導(dǎo)致其抗原性變異較大。因此，有效的HCV疫苗應(yīng)包含大部分主要基因型的抗原表位，或根據(jù)該地HCV基因型分布特點來制備相應(yīng)的預(yù)防性疫苗。

2.5 有助于了解HCV傳播的地域分布特征：

HCV感染呈現(xiàn)全球分布，但是不同地區(qū)的HCV基因型分布卻存在著較大的差異，這種差異可能是由于地域或者人群的不同造成HCV的進(jìn)化和親緣關(guān)系、HCV宿主間的免疫應(yīng)答機(jī)制的不同造成的。目前非洲大陸及東南亞地區(qū)是世界上檢測到HCV基因亞型最多的地區(qū)，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化理論分析認(rèn)為，二三百年來HCV在各大洲間的傳播很頻繁，但是現(xiàn)在卻很難確定6種HCV基因型的共同祖先、其特定的起源地理位置。另外，HCV基因分型的研究還有助于了解HCV總體的變異趨勢和判斷HCV的傳播途徑，對于預(yù)防和控制HCV感染也具有重要現(xiàn)實意義。

參考文獻(xiàn)

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