摘要：

目的：研究小檗堿對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）誘導(dǎo)ECV-304細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。方法：小檗堿（Berberine，BBR）預(yù)處理ECV-304細(xì)胞2h后，用S.aureus感染細(xì)胞，采用半定量RT-PCR及Western-blot法檢測(cè)金黃色葡萄球菌感染后ECV-304細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：小檗堿預(yù)處理ECV-304后再感染S.aureus可顯著性增加凋亡相關(guān)細(xì)胞因子Bcl-2mRNA水平及蛋白表達(dá)量，而Bax和Caspase-3表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：小檗堿可以調(diào)節(jié)S.aureus誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制ECV-304細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：小檗堿；金黃色葡萄球菌；ECV-304；凋亡

EffectsofberberineonapoptosisrelatedgenesofECV-304cellsinducedbystaphylococcusaureus

Peide-cui，Xiongchuan-yin，Biai-fen，Huhan-bin

Abstract：

DepartmentofClinicalLaboratory，GuangzhouHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，Guangzhou，Guangdong510800，China

AbstractObjective：TostudytheprotectionofberberineagainstECV-304apoptosisinducedbyStaphylococcusaureus（S.aureus）viaregulatingBcl-2，Baxandcaspase-3expression.Methods：ECV-304werepretreatedwith128μg/mLBBRfor2h，thenSaureuswasadded.Theexpressionlevelsofapoptosisrelatedgenesweredetectedwithsemi-quantityRT-PCRandWestern-blot.Results：PretreatmentofBBRhelpedtosurviveinSaureus-inducedECV-304.BBRsignificantlyincreasedtheexpressionlevelsofBcl-2anddecreasedthatofBaxandCaspase-3afterstaphylococcusaureusinfection.Conclusion：BerberinecanregulatetheexpressionofapoptosisrelatedgenesofECV-304cellsinducedbyS.aureus.

Key words：Berberine（BBR）；Staphylococcusaureus（S.aureus）；ECV-304cells；apoptosis

【中圖分類號(hào)】

R856.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）08-0003-02

小檗堿又名黃連素，是一種具有悠久藥用歷史的異喹啉類生物堿，臨床長(zhǎng)期用于抗腸道細(xì)菌感染^[1]。研究表明，小檗堿能改善炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)JNK的磷酸化及caspase-12和caspsae-3水平，從而抑制炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡^[2]。金黃色葡萄球菌可以感染并誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡^[3]，在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞凋亡有利于細(xì)菌侵入及毒素的擴(kuò)散，從而引起組織損傷，抑制細(xì)胞凋亡對(duì)感染性疾病的控制具有一定意義。本實(shí)驗(yàn)的目的是了解小檗堿是否可以調(diào)節(jié)S.aureus感染的ECV-304細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)，為治療其感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞系：

S.aureu標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，培養(yǎng)基為哥倫比亞血瓊脂平板（梅里埃）及LB培養(yǎng)基（Oxoid）。ECV-304由四川大學(xué)華西基礎(chǔ)與法醫(yī)學(xué)院微生物教研室保存并提供，細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI1640（Hyclone）。

1.1.2 主要試劑：

鹽酸小檗堿購(gòu)自本院藥房（康和藥業(yè)），RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清（Hyclone），TRIzol試劑（Invitrogen），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），PVDF膜（millipore），細(xì)胞裂解液和ECL試劑盒（Beyotime），一抗及羊抗兔IgG（Boster）。

1.2 方法

1.2.1 藥物原液的配制及保存：

稱取鹽酸小檗堿，用無(wú)菌去離子水配制成2048μg/mL的藥液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后分裝于滅菌的EP管中，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)：

將甘油保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)種血瓊脂平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，取單菌落接種于3mlLB液體培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)箱，200rpm振蕩過(guò)夜，至細(xì)菌生長(zhǎng)平臺(tái)期。ECV-304用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 小檗堿預(yù)處理S.aureu感染ECV-304細(xì)胞：

LB過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌離心集菌，然后無(wú)菌PBS洗3次，用不含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液重懸備用。胰蛋白酶消化ECV-304，無(wú)菌PBS漂洗3次后用不含抗生素的RPMI1640重懸，接種12孔板，37℃放置30min。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組（C），BBR組，S.aureus組及BBR+S.aureus共四組。BBR組和BBR+S.aureus組孔內(nèi)分別加128μg/mL的BBR預(yù)處理2h后，每孔按照細(xì)胞：細(xì)菌=1：100的比例將細(xì)菌懸液加入相應(yīng)孔內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h。

1.2.4 細(xì)胞總RNA提取：

采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，用DEPC處理水20μl溶解RNA。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增：

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書上的操作將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用cDNA作為模板PCR擴(kuò)增相關(guān)基因，基因引物序列及擴(kuò)增片段大小見表1，引物合成由上海Invitrogen公司完成。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并在紫外燈下觀察拍照。以GAPDH為內(nèi)參，BandScan軟件分析各個(gè)條帶的光密度值，計(jì)算各組細(xì)胞因子mRNA表達(dá)相對(duì)值（目的基因/內(nèi)參基因）。

1.2.6 WB檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：

每孔加入100μl0.25%胰酶，37℃消化5min后加入1ml完全培養(yǎng)基終止消化，吹下細(xì)胞并分別收集于1.5mlEP管，4000rpm5min離心，棄上清收集細(xì)胞。加入150μl細(xì)胞裂解液及2μlPMSF，于冰上反復(fù)吹打2min，將EP管置于冰上，每5min振蕩一次共30min使細(xì)胞充分裂解，4℃，12000rpm離心15min，上清為總的細(xì)胞蛋白溶解成分。按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE，分離膠12%，濃縮膠5%，電泳時(shí)間1.5h。350mA恒流電泳90min轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉中4℃封閉過(guò)夜，然后用1×TBST漂洗3次，封閉后的膜放入雜交袋中，加入1：200稀釋的一抗于袋內(nèi)，4℃過(guò)夜，TBST漂洗3次加PBS1：5000稀釋的羊抗兔IgG二抗，置37℃孵育1h，TBST振蕩洗膜3次，每次10min。ECL方法顯色后用BIO-RAD凝膠成像儀檢測(cè)蛋白并拍照。以β-actin蛋白為內(nèi)參，BandScan軟件分析條帶的光密度值，計(jì)算各組細(xì)胞因子蛋白的相對(duì)表達(dá)量（目的蛋白/內(nèi)參蛋白）。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，各組數(shù)據(jù)采用X±s表示，結(jié)果用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件中的

2 結(jié)果

2.1 凋亡相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平改變：電泳結(jié)果用BandScan軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算各組細(xì)胞因子mRNA表達(dá)相對(duì)值（目的基因/內(nèi)參基因）。結(jié)果表明S.aureus的感染導(dǎo)致Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組相比較有顯著性差異（p<0.05），感染S.aureus的細(xì)胞抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)顯著性下降，而促凋亡細(xì)胞因子Bax和caspase-3表達(dá)量顯著性增加。用BBR處理后再感染S.aureus發(fā)現(xiàn)，與S.aureus組比較，Bcl-2的表達(dá)量顯著性上升而Bax和caspase-3表達(dá)量顯著性下降（p<0.05，圖1）。

*p<0.05與對(duì)照組（C）相比，**p<0.05與S.aureus組相比

2.2 凋亡相關(guān)細(xì)胞因子蛋白水平改變：BandScan軟件分析WesternBlot條帶的光密度值，計(jì)算各組細(xì)胞因子蛋白的相對(duì)表達(dá)量（目的蛋白/內(nèi)參蛋白），結(jié)果顯示，S.aureus的感染導(dǎo)致Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)量與正常對(duì)照組相比較有顯著性差異（p<0.05，圖2），用BBR處理后再感染S.aureus發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白表達(dá)量與S.aureus組比較顯著性上升而Bax和caspase-3蛋白表達(dá)量顯著性下降。

3 討論

細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞在凋亡刺激信號(hào)作用下通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)死亡機(jī)制，經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終發(fā)生細(xì)胞程序性變性和死亡的過(guò)程。細(xì)胞在凋亡的過(guò)程中，凋亡基因?qū)?xì)胞凋亡的發(fā)生起重要作用，其中Bcl-2家族中Bcl-2和Bax基因分別是代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡的基因，且Bax是Bcl-2活性的主要調(diào)控因子^[4]。半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，其中Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，一旦被激活，凋亡不可避免^[5]。我們的研究結(jié)果顯示，當(dāng)用BBR預(yù)處理細(xì)胞后再用S.aureus感染，細(xì)胞內(nèi)抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)上升，而促凋亡因子Bax和Caspase-3表達(dá)量下降。Bcl-2具有保護(hù)細(xì)胞的功能，該結(jié)果表明小檗堿可以通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)來(lái)保護(hù)S.aureus誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞凋亡。

S.aureus是醫(yī)院感染和社區(qū)感染的重要病原菌之一，近年來(lái)由于抗生素的廣泛使用導(dǎo)致大量耐藥菌株的產(chǎn)生，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的出現(xiàn)使該菌感染的治療變得更為困難^[6]。MRSA治療難度大，病死率高，尤其是對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌（VRSA）的出現(xiàn)使得抗生素的選擇尤為謹(jǐn)慎，新的治療藥物的研究及開發(fā)迫在眉睫。小檗堿又名黃連素，是一種具有悠久藥用歷史的異喹啉類生物堿，作為清熱解毒藥和抗菌藥在臨床上已應(yīng)用多年。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能通過(guò)干擾細(xì)菌代謝及DNA合成等途徑發(fā)揮抗菌作用，并且其可增加MRSA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，兩者聯(lián)用對(duì)MRSA有協(xié)同抗菌作用[7，8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，作為傳統(tǒng)抗炎、抗菌中藥成分的BBR還可能通過(guò)抑制S.aureus誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而起到抗菌作用，這可能是BBR對(duì)S.aureus引起的感染具有一定療效的機(jī)理之一。

本研究我們采用S.aureus感染ECV-304為體外感染模型，檢測(cè)感染細(xì)胞及BBR預(yù)處理細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化，了解BBR抗S.aureus感染的機(jī)理。結(jié)果表明BBR通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)來(lái)抑制S.aureus誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為以后找到一種理想、有效而不會(huì)產(chǎn)生耐藥性的預(yù)防及治療S.aureus感染的中藥成分提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為形成具有我國(guó)特色的用中藥防治感染性疾病的體系提供支持。

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