摘要： 目的：制備微生物定量質(zhì)控樣品，并對樣本的穩(wěn)定與均勻性進行檢測分析，判斷是否符合日常工作室內(nèi)質(zhì)控的要求。方法：將一定濃度的甘油-營養(yǎng)肉湯菌懸液快速凍存于液氮中。對短期內(nèi)凍存樣品連續(xù)隨機抽取10個樣，進行菌落總數(shù)的檢測。應(yīng)用單因素方差分析法對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：以α=0.05為檢驗水準，該質(zhì)控樣樣品間無顯著性差異（P=0.159）。結(jié)論： 樣品短期內(nèi)具均勻性和一定穩(wěn)定性。該質(zhì)控樣品，可對微生物實驗室定量檢測的短期質(zhì)控提供一定的幫助

關(guān)鍵詞：： 均勻性；質(zhì)量控制；微生物

【中圖分類號】R155【文獻標識碼】A【文章編號】1672-8602（2014）02-0017-02

在微生物學定量檢驗領(lǐng)域，由于其檢驗對象的特性，日常工作的過程質(zhì)控，因缺乏高可信度、價格優(yōu)廉的標準物質(zhì)，往往只能通過培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等的檢查來確定檢驗過程的可控性，但有時人員或其它因素變化可給檢測結(jié)果帶來一定的隨意性和不確定性。同時或因不能及時發(fā)現(xiàn)過程失控而忽略，或因?qū)z測過程懷疑而使結(jié)果的可信度降低，從而無法保證檢測質(zhì)量。因此，制備達到一定均勻性與穩(wěn)定性的微生物定量質(zhì)控樣品，可促進日常工作的檢測過程質(zhì)量控制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品：實驗室自備樣品，為含一定量菌落數(shù)的甘油-腦心浸出液。凍干菌株：金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003（來源：中國食品藥品檢定研究院）。

1.1.2 主要儀器與試劑：（1）主要儀器：BLON-08型均質(zhì)器，立式高壓滅菌鍋，DHP-9160恒溫培養(yǎng)箱，BHC-1300IIA2生物安全柜、YDS-30-125液氮罐。（2）主要試劑：甘油、氯化鈉（均為廣東汕頭化工廠生產(chǎn)），營養(yǎng)肉湯、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液（均為北京陸橋技術(shù)有限責任公司生產(chǎn)）；所有試劑按其相應(yīng)要求制備與滅菌，均在有效期內(nèi)使用。

2.2方法

2.2.1樣品制備： 取凍干菌株，按要求加入一定量營養(yǎng)肉湯在（36.0±0.5）℃（24±2）小時復蘇。分別取復蘇液1ml加入60ml營養(yǎng)肉湯中，（36.0±0.5）℃（24±2）小時。分別取該培養(yǎng)液按GB4789.2-20l0菌落總數(shù)[1]檢驗其所含菌落數(shù)，同時該培養(yǎng)液置于4℃冰箱中。之后將該培養(yǎng)液用4℃的甘油-營養(yǎng)肉湯稀釋至含菌落為6000～10000CFU/ml的菌懸液，將該菌懸液分裝于凍存管中，2.2ml/管，作為凍存樣品?？焖僖来沃糜谝旱獨鈱?、液氮中凍存。

2.2.2操作步驟：菌落總數(shù)：對凍存的樣品每日隨機抽取1個樣品進行檢測、共10個[2]。樣品取用時，將凍存管快速置于37℃溫水中，1分鐘內(nèi)快速解凍。無菌條件下將樣品開啟、取樣，每份樣品進行平行試驗。所有測試均應(yīng)在可重復條件下進行。對所取樣品，分成2份，并進行3個系列的10倍倍比稀釋，混合均勻，按4789.2-2010操作，分別吸取各稀釋液1mL到2個平皿中，傾入保溫為45℃的平板計數(shù)瓊脂，混勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置放于36℃恒溫培養(yǎng)箱中48h培養(yǎng)，取出平板進行菌落計數(shù)。同時分別以稀釋液和培養(yǎng)基做空白對照。

2.2.3均勻性檢驗：可以通過檢驗各樣本均值是否具有統(tǒng)計學意義上的差異來判斷制備樣品的均勻性，常采用單因素方差分析法、t檢驗法、極差檢驗法等統(tǒng)計學方法[3-4]。對生物類樣品可采用單因素方差分析 （one-way ANOVA）來進行樣品均勻性的統(tǒng)計分析判斷[4]。單因素方差分析（one-way ANOVA）又稱為一維方差分析，研究單個因素對觀測變量的影響，對由單一因素影響的一個（或幾個相互獨立的）因變量由因素各水平分組的均值之間的差異進行檢驗，判斷是否具有統(tǒng)計意義。因此，若各分組間存在統(tǒng)計學差異，說明該因素（分類變量）對因變量存在顯著影響。 計算公式見表1。

3結(jié)果

單因素方差分析結(jié)果見表2。檢測結(jié)果見表3，

4討論

為適應(yīng)隨著人民生活水平的提高及技術(shù)水平的發(fā)展，相關(guān)產(chǎn)品細菌學指標檢測標準或方法不斷得到提高與完善，由此對微生物實驗室的檢測質(zhì)量控制提出的要求也越來越嚴謹與細致[5]。目前，為確保實驗室檢測能力與質(zhì)量控制，主要途徑是除了定期參加相關(guān)項目的實驗室能力驗證外，在細菌學指標檢測的日常工作中，需要對培養(yǎng)基進行適應(yīng)性與對照菌株的生長能力檢查，實驗過程帶入陽性對照、空白對照或陰性對照，對實驗環(huán)境的潔凈程度進行定期監(jiān)測與控制，對其它實驗條件如溫度、時間等進行控制，同時不斷加強技術(shù)人員的專業(yè)技能培訓[5-9]。若是能在日常工作中的定量檢測實驗過程帶入定量質(zhì)控樣品，則可以從另一個方面反映實驗室的檢測質(zhì)量，尤其在實驗條件發(fā)生改變而又未能及時發(fā)現(xiàn)時可以發(fā)出警示，同時對不同檢測技術(shù)人員的檢測過程起到一個平行對照的作用，也有助于評定實驗室的不確定度。其不隨檢測人員、日常檢測樣品等的改變而受到影響。目前已出現(xiàn)商品化的定量質(zhì)控樣品，也有獲得國家批準成為標準物質(zhì)的，但作為日常工作的質(zhì)控樣品，需要考慮到成本因素。因此，制備實驗室日常工作質(zhì)控樣品，具有重要的意義。

通過隨機抽樣，采用單因素方差分析法對短期保存的10個樣本進行統(tǒng)計分析，樣品內(nèi)和樣品間均無顯著性差異，由此可初步說明該樣本是均勻的。要注意的是在檢測前對所用培養(yǎng)基進行適應(yīng)性檢查，所用菌株具有良好的活性；檢測過程中取樣量需準確、取樣方式、測定方法具備一定的平行性，防止各稀釋度交叉污染等。此次樣本為單一菌株是日常工作定量質(zhì)控的初步探索。作為菌落總數(shù)檢驗的過程質(zhì)控，混合菌株的質(zhì)控樣更具代表性。但由于不同細菌的特性不同，在相同培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件下的生長情況體現(xiàn)差異，在混合生長時可能存在一定的相互作用或影響及其程度的大小[10]、在保存及定量檢測時是否能夠表現(xiàn)出一定規(guī)律尚不能完全確定，對樣本的均勻性產(chǎn)生一定的影響，而混合多少種菌株作為質(zhì)控品，對菌落總數(shù)指標才具代表意義，尚需要不斷摸索、改進與完善。

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