摘 要：目的：從土壤中分離金黃色葡萄球菌。方法：選擇性培養(yǎng)基平板涂布分離法。結(jié)果：分離到的菌株經(jīng)菌落鑒定、革蘭氏染色和形態(tài)鑒定以及金黃色葡萄球菌測(cè)試卡鑒定，都符合金黃色葡萄球菌特征。結(jié)論：所采用從土壤中分離微生物的方法快速，簡(jiǎn)便，可靠，可在教學(xué)中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌； 分離； 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)

中圖分類(lèi)號(hào)：R378.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-3315（2014）10-165-001

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）廣泛分布于自然界，土壤、空氣、水體、塵埃、人和動(dòng)物的身體表面都可找到。因而由它引起食品污染的機(jī)會(huì)很多?？梢砸鹑撕蛣?dòng)物的感染。在人體主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股溝、會(huì)陰部和新生兒臍帶殘端等部位，偶爾也寄生于口咽部、皮膚、腸道及陰道口等，是醫(yī)院感染常見(jiàn)的病原體之一。金黃色葡萄球菌腸毒素是世界性衛(wèi)生難題，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，我國(guó)每年發(fā)生的此類(lèi)中毒事件也非常多[1]。近年來(lái)，美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌[2]。

金黃色葡萄球菌在平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑一般為1～2mm。血平板菌落周?chē)纬赏该鞯娜苎h(huán)。典型的金黃色葡萄球菌個(gè)體形態(tài)為球型，直徑為0.5～1μm，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無(wú)芽胞、無(wú)鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜，革蘭氏染色陽(yáng)性。它對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通牛肉膏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧，最適宜生長(zhǎng)溫度37℃，最適宜生長(zhǎng)pH7.4，干燥環(huán)境下可存活數(shù)周。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可以在10%～15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)。對(duì)磺胺類(lèi)藥物敏感性低，但對(duì)青霉素、紅霉素等高度敏感。對(duì)堿性染料敏感，十萬(wàn)分之一的龍膽紫液即可抑制其生長(zhǎng)。為控制金黃色葡萄球菌對(duì)人類(lèi)的危害以及在生物教學(xué)中常常要分離其菌株對(duì)其進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的分離方法需要對(duì)菌落多次純化，實(shí)驗(yàn)麻煩。因而探索快速可靠的分離方法，獲得金黃色葡萄球菌在實(shí)際工作中有積極意義。

一、材料

（一）培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（13%NaCl）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉130g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min后倒平板。

（二）試劑

復(fù)方磺胺甲惡唑，革蘭氏染液，甲苯胺蘭-DNA，金黃色葡萄球菌測(cè)試卡（廣州綠洲生化科技股份有限公司出品）。

二、方法

（一）金黃色葡萄球菌的分離

稱(chēng)取10g土樣，在無(wú)菌條件下放入滅菌的三角瓶中，加入90mL蒸餾水，再加入0.2mg復(fù)方磺胺甲惡唑振蕩10min，使土樣充分混勻，利用金黃色葡萄球菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物敏感性低的特性，殺死其它細(xì)菌。從三角瓶中取1mL上清液放入一支無(wú)菌試管（15×150mm）中，按10倍梯度稀釋法稀釋成10-5的土壤稀釋液后，分別取200μL涂布于牛肉膏蛋白胨高鹽培養(yǎng)基平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h。利用高鹽培養(yǎng)基抑制其它細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而分離得到金黃色葡萄球菌。

（二）金黃色葡萄球菌的鑒定

1.菌落形態(tài)。菌落較小，圓形、直徑1～2㎜，較濕，較透明，邊緣整齊，隆起，略帶淡綠色。

2.染色觀察：從平板上挑取可疑性菌落進(jìn)行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈單個(gè)或葡萄狀排列、無(wú)芽孢、莢膜，單個(gè)菌體直徑為0.5～1μm。

3.金黃色葡萄球菌快速測(cè)試片鑒定。該測(cè)試片含有選擇性培養(yǎng)基（改良的Baird-Parker營(yíng)養(yǎng)物及冷水可溶的膠體）和專(zhuān)一性的酶顯色劑，即熱穩(wěn)定核酸酶（Tnase）反應(yīng)片，包含有甲苯胺藍(lán)（toluidineblue-O） -DNA及四唑指示劑（tetrazolium），此指示劑有助于菌落的計(jì)數(shù)及確定葡萄球菌熱穩(wěn)定核酸酶的存在。使用該測(cè)試片培養(yǎng)15～24h就可確認(rèn)是否有金黃色葡萄球菌的存在。操作方法按測(cè)試片使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

（1）樣品處理。用無(wú)菌接種環(huán)取待測(cè)菌落一個(gè)放入含有2mL無(wú)菌水的試管中，適當(dāng)振蕩均勻，制成樣品液（記錄菌落特征并編號(hào)）。

（2）接種。將金黃色葡萄球菌快速測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，揭開(kāi)上層膜，用無(wú)菌注射器或吸管吸取1mL樣品液慢慢均勻地滴加到金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置5min，使培養(yǎng)基凝固，最后用手輕輕地壓一下。

（3）培養(yǎng)及結(jié)果判定。將測(cè)試片疊在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過(guò)12片。37℃，培養(yǎng)15～24h，觀察結(jié)果。測(cè)試片上紫紅色的菌落為金黃色葡萄球菌。

（4）注意事項(xiàng)。

①在環(huán)境溫度20～30℃下操作；檢測(cè)卡極易受潮，打開(kāi)小包裝后應(yīng)立即使用。②所有跟待檢樣品接觸的器具都應(yīng)滅菌，或一次性滅菌器具。③樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)用1mol/LNaOH或1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH。

三、小結(jié)與討論

利用金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，對(duì)磺胺類(lèi)藥物有敏感性低的特性，制備選擇性培養(yǎng)基，采用平板涂布法分離到的菌株，經(jīng)菌落特征鑒定、革蘭氏染色顯微鏡形態(tài)觀察鑒定以及金黃色葡萄球菌測(cè)試卡鑒定，都符合金黃色葡萄球菌特征。所采用從土壤中分離金黃色葡萄球菌的方法快速，簡(jiǎn)便，可靠，可在教學(xué)和實(shí)際工作中推廣應(yīng)用。

基金項(xiàng)目：貴州省高校專(zhuān)業(yè)綜合改革試點(diǎn)項(xiàng)目：黔教高發(fā)[2012]426號(hào)；黔南民族師范學(xué)院微生物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目：院政發(fā)[2011]04號(hào)；黔南民族師范學(xué)院優(yōu)秀教學(xué)團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目，院教發(fā){2011}5號(hào)。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉旭偉，葛文霞.金色葡萄球菌腸毒素[J]微生物學(xué)雜志，2008，28（5）：86～89

[2]高濤.食品中金黃色葡萄球菌腸毒素及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J]福建分析測(cè)試，2003，12（2）：1775～1778