蘇慧慧等

摘 要 2012～2013年，于廣州地區(qū)采集番茄青枯病病樣并進(jìn)行病原分離工作，經(jīng)分子鑒定后獲得9個(gè)菌株。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了其中9個(gè)菌株的egl基因序列，采用國(guó)際新興的青枯菌演化型分類框架進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中分離自不同寄主的青枯菌菌株egl基因序列為參考序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。結(jié)果表明：9個(gè)菌株屬于青枯菌演化型I型即亞洲分支菌株的4個(gè)序列變種，分別為序列變種13、14、34、44。以高抗青枯病番茄材料‘興農(nóng)021和敏感材料‘金冠3號(hào)為試材，評(píng)價(jià)了其中5個(gè)菌株的致病力，結(jié)果表明3-1和18-6致病力較高。

關(guān)鍵詞 青枯病菌；番茄；分子鑒定；致病力分析

中圖分類號(hào) S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To provide theoretic guidance to disease-resistant breeding， a new phylotype classification schemes and pathogenicity determination to investigate Ralstonia solanacearum strains of tomato was used. The result of phylotype-specific PCR with 759/760 primers showed that the specific 281 bp fragment of Ralstonia solanacearum strains was amplified from all 9 isolates. The egl gene fragments of the 9 strains were amplified by PCR using the universal primer Endo-F/R with a 750 bp fragment， phylogenetic analysis examined the partial sequence of the egl gene of 9 isolates and 29 reference strains， the result showed that all of the 9 isolates were belonged to phylotype I. Five isolates was used for the pathogenicity tests by the methods of cutting and soaking roots with 108 cfu/mL， 3-1 and 18-6 was the high virulent strains under the highly resistant varieties ‘Xingnong 021 and sensitive varieties ‘Jinguan 3.

Kew words Ralstonia solanacearum；Tomato；Phylotype identification；Pathogenicity determination

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.031

番茄（Solanum Lycopersicum）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物和模式植物之一[1]。由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum Simth）侵染引起的青枯?。˙acterial wilt）是嚴(yán)重影響番茄產(chǎn)量的重要細(xì)菌性病害[2]，在中國(guó)南方番茄產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、海南危害最為嚴(yán)重[3]。青枯菌菌系復(fù)雜，且具有廣泛的寄主，可侵染54個(gè)科的400多種植物[4]，其中番茄、煙草、馬鈴薯、茄子、花生等受害最為嚴(yán)重[5-7]。

青枯菌群體在不同地區(qū)和寄主來(lái)源等具有高度的變異性及適應(yīng)性，且表現(xiàn)出生理分化和菌系多樣性[7]。Prior等[8]提出并建立了依次將青枯菌劃分為種（Species）、演化型（Phylotype）、序列變種（Sequevar）及克?。–lone）4個(gè)不同水平分類單元的分類框架，根據(jù)地理起源密切相關(guān)將演化型分為演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型，其中來(lái)自亞洲的生化變種3、4和5歸為演化Ⅰ型，美洲的生化變種1、2和2T為演化Ⅱ型，來(lái)自非洲的生化變種1和2T為演化Ⅲ型，印度尼西亞的生化變種1、2、2T為演化Ⅳ型。序列變種是以內(nèi)切葡聚糖酶基因（endoglucanase，egl）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，一組序列高度保守的菌株集合體。國(guó)際上已經(jīng)鑒定出51個(gè)序列變種，目前主要危害中國(guó)青枯菌分屬演化型Ⅰ和Ⅱ，以及1、12、13、14、15、16、17、18、34、44和48等11個(gè)序列變種[4]。該方法可精確反映青枯菌的地理起源及種內(nèi)遺傳多樣性。

目前，番茄青枯病的防治主要通過(guò)選育高抗品種、農(nóng)業(yè)措施、化學(xué)藥劑和生物農(nóng)藥等方法[3]，其中生物防治得到了廣泛的關(guān)注[9-10]。然而，青枯菌的小種多樣性以及與寄主、環(huán)境之間復(fù)雜的互作，使得抗青枯病的育種十分困難[2]。本研究的目的是分離并開(kāi)展廣州地區(qū)番茄青枯菌系統(tǒng)發(fā)育分析及致病力評(píng)價(jià)。通過(guò)特異引物的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，對(duì)番茄發(fā)病植株的青枯菌進(jìn)行分離、純化、鑒定與檢測(cè)其致病性，為番茄青枯病的防控工作及番茄的抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1 材料

青枯菌病樣采集的番茄品種和來(lái)源見(jiàn)表1；TTC和NB培養(yǎng)基配方參照徐進(jìn)等[11]的研究方法，培養(yǎng)基所用藥品均購(gòu)自鼎國(guó)生物公司；PCR擴(kuò)增所用rTaq和dNTP購(gòu)自Takara；膠回收試劑盒購(gòu)自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株的采集與分離 2012～2013年從廣東省農(nóng)科院大豐基地和鐘落潭基地采集266F1、Y18、齊達(dá)利、艾美瑞、L35BD、NEW105等9份番茄抗青枯病敏感材料的發(fā)病植株地上部10 cm莖段樣品，室內(nèi)切片，對(duì)在顯微鏡下觀察有細(xì)菌溢膿現(xiàn)象的材料，參照徐進(jìn)等[11]青枯菌分離純化方法獲得純化菌株，于4 °C冰箱內(nèi)斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 供試菌株的分子生物學(xué)鑒定 采用簡(jiǎn)易提取法[12]提取青枯病菌菌株的基因組DNA，以用于實(shí)驗(yàn)的模板。

參照Prior等[8]的研究方法，采用青枯菌特異引物759-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC和760-GTCGCC

GTCAGCAATGCGGAATCG鑒定青枯菌。序列變種鑒定引物Endo-F-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC和Endo-R-GCGTTGCCCGGCACGAACACC用于擴(kuò)增egl基因序列。所用引物由上海英駿生物公司合成。

PCR擴(kuò)增體系和程序參照潘哲超等[7]的研究方法，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收后送生工生物（上海）股份有限公司，用引物Endo-F進(jìn)行序列測(cè)序。

1.2.3 供試菌株的致病力鑒定 參照何自福等[12]的研究方法，選取經(jīng)測(cè)序鑒定的青枯菌18-1、17-2、18-6、3-1、2-6菌株，在TTC 平板上活化培養(yǎng)48 h 后，挑取中間呈淺粉紅色、邊緣乳白色的菌落于NB液體培養(yǎng)基（蛋白凍10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，定容至1 000 mL， pH值7.4），30 ℃，200 r/min培育24 h，調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度為1.0×108 cfu/mL，采用浸根接種法，將4～5葉期番茄幼苗從育苗盤中拔出，沖洗凈根部土壤，在青枯菌菌液中浸泡20 min，然后移栽于裝有滅菌土的塑料盆中，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30株。后續(xù)水肥按常規(guī)管理。接種后每7 d調(diào)查1次，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄青枯菌菌株的分離和分子鑒定

2012～2013年從田間番茄發(fā)病植株中分離得到9株分離物（表1），各菌株在TTC平板培養(yǎng)48 h后，菌落經(jīng)劃線培養(yǎng)后具有流動(dòng)性，中央呈粉紅色，外緣為乳白色，形狀不規(guī)則（圖1）。

分離自番茄發(fā)病植株的9個(gè)菌株經(jīng)青枯菌特異引物759/760均可擴(kuò)增得到0.3 kb的片段，說(shuō)明此9個(gè)菌株為青枯菌；其中9個(gè)菌株經(jīng)egl引物擴(kuò)增可得到750 bp的片段，經(jīng)測(cè)序獲得egl基因序列并獲得NCBI登錄號(hào)（KJ913687-KJ913695）。

2.2 番茄青枯菌菌株egl基因系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI中檢索并下載不同演化型及序列變種的青枯菌菌株egl基因序列（表2），并以此為參考，比對(duì)分析待測(cè)菌株的測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。所有待測(cè)菌株均屬于PhylotypeⅠ型的序列變種，且待測(cè)菌株與已知序列變種序列比對(duì)為100%，其中菌株2-6與O3，17-2與Zo4，3-1、3-3、3-5與PSS219，18-1、20-3、18-10與JT523，18-6與PSS81聚類在一起；其中NEW105分離的青枯菌分屬于序列變種13（18-1、18-10）和14（18-6），即相同品種分離得到不同青枯病菌株，田間番茄青枯病是由多個(gè)不同的青枯菌菌株復(fù)合侵染造成的。

2.3 番茄青枯菌菌株的致病力評(píng)價(jià)

以番茄高抗材料興農(nóng)021，敏感材料金冠3號(hào)為試材，選取分離自不同番茄病樣的5個(gè)菌株進(jìn)行致病力評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖3。感病品種金冠3號(hào)接種各測(cè)試菌株21 d后發(fā)病率超過(guò)50%，在抗病品種興農(nóng)021接種測(cè)試菌株3-1和18-6 28 d后超過(guò)20%，接種試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明測(cè)試菌株3-1和18-6為高致病力菌株。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)青枯菌鑒定方法從分離純化到生化鑒定，一般需1～2周時(shí)間完成，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫熒光抗體染色（IF）、DNA探針、PCR等技術(shù)的發(fā)展加快了對(duì)青枯菌檢測(cè)的靈敏度和時(shí)效性[3]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者根據(jù)青枯菌hrp基因和16S rDNA序列差異設(shè)計(jì)引物在馬鈴薯、煙草、番茄、香蕉等作物快速、準(zhǔn)確分離鑒定青枯菌方面開(kāi)展了大量研究工作[5，6-7，12-13]。Opina等[14]研究發(fā)現(xiàn)一對(duì)青枯菌特異引物759/760，并成為在番茄、辣椒、煙草、馬鈴薯等[11，15-17]多種作物分離青枯菌菌株的快速特異的檢測(cè)手段；本研究分離得到的9個(gè)青枯菌分離物均具有利用759/760特異引物擴(kuò)增得到281 bp的條帶，說(shuō)明其均為青枯菌菌株。

青枯菌與寄主的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，演化出明顯的生理及致病力分化特征[7]。Prior等[8]在傳統(tǒng)分類方法研究的基礎(chǔ)上提出種、演化型、序列變種和克隆的演化型分類框架，在序列變種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)過(guò)程中，菌株的內(nèi)切葡聚糖酶基因egl或hrpB等核心基因序列同源性大于99%即可認(rèn)定為同一序列變種[4]。Xu等[18]基于演化型分類框架對(duì)國(guó)內(nèi)13個(gè)省、17種不同寄主植物上的286個(gè)青枯菌株的研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)青枯菌種內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，對(duì)來(lái)自廣東廣州（序列變種44）、廣西（序列變種14）、湖北（序列變種15）和四川（序列變種44）各1份、福建8份（13、14、15、16、17、18、44）共計(jì)12份番茄青枯病菌分屬6個(gè)序列變種。潘哲超等[7]通過(guò)對(duì)福建及貴州62個(gè)煙草青枯菌系統(tǒng)發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)其均屬于亞洲分支的4個(gè)序列變種（15、17、34、44），其中15和17為優(yōu)勢(shì)菌系。本研究對(duì)廣州大豐和鐘落潭地區(qū)的番茄青枯病菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，9個(gè)待測(cè)菌株均屬于演化I型的4個(gè)序列變種（13、14、34和44）；其中分離自廣州大豐Y18中3個(gè)菌株（3-1、3-3、3-5）均與序列變種34的標(biāo)準(zhǔn)菌株臺(tái)灣番茄青枯病菌株P(guān)SS219一致，2-6與廣西油橄欖O3序列變種44一致；分離自廣州鐘落潭的NEW103的18-6與序列變種14的標(biāo)準(zhǔn)菌株臺(tái)灣番茄青枯病菌株P(guān)SS81一致，而18-1、18-10和20-3為留尼旺島馬鈴薯JT523序列變種13一致。由于本研究供試菌株較少，且采集地點(diǎn)為廣州市，僅能部分印證和補(bǔ)充前人研究結(jié)果，青枯病是南方地區(qū)番茄生產(chǎn)的主要限制因素，而基于新的演化型分類框架的序列變種與國(guó)內(nèi)其他番茄主產(chǎn)區(qū)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系需進(jìn)一步研究。

本研究進(jìn)一步對(duì)4個(gè)序列變種的5個(gè)菌株進(jìn)行致病力分析，結(jié)果表明，不同菌株致病力差異較大，其中菌株18-6和3-1致病力較強(qiáng)。由于番茄青枯病一般為開(kāi)花和坐果期發(fā)病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，且青枯菌群具有高度的適應(yīng)性和變異性，因此開(kāi)展青枯菌的系統(tǒng)發(fā)育及序列變種的致病性評(píng)價(jià)對(duì)指導(dǎo)番茄抗青枯病育種進(jìn)程有重要意義。

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