吳轉(zhuǎn)娣等

摘 要 將雙價抗蟲基因，即修飾的蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因（Cry1Ac）和修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（sck）導(dǎo)入甘蔗優(yōu)良品種ROC22，獲得潮霉素抗性轉(zhuǎn)化植株95株，35株能檢測到外源抗蟲基因，獲得的13株RT-PCR雙基因均呈陽性的甘蔗植株，斑點雜交檢測有4株呈陽性。結(jié)果表明：外源抗蟲基因已導(dǎo)入甘蔗基因組中。

關(guān)鍵詞 甘蔗；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；Cry1Ac；sck；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號 S688 文獻標識碼 A

Abstract In the paper sugarcane， the cultivar ROC22 was genetically transformed with both Cry1Ac gene and sck gene， and selected with hygromycin B via agrobacterium-mediated transformation system. 95 transformed plantlets were obtained， and 35 of them showed positive by polymerase chain reaction. Furthermore， thirteen PCR-positive plantlets were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction， all were positive. Thirteen of the RT-PCR-positive plants were taken for dot blot analysis， four of which were positive. The result showed that foreign genes were integrated into the sugarcane genome.

Key words Sugarcane； Agrobacterium-mediated； Cry1Ac； sck； Genetic transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.023

甘蔗抗蟲基因工程育種一直是甘蔗產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向，每年中國甘蔗產(chǎn)業(yè)因螟蟲危害導(dǎo)致的損失高達數(shù)十億，甚至上百億元，另外每年數(shù)十萬噸劇毒農(nóng)藥投入蔗田，殺蟲效果并不理想，反而加重了害蟲的抗性，并導(dǎo)致嚴重的環(huán)境污染和人畜中毒事故[1]。近年來，隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展，農(nóng)村人口大量進入城市，甘蔗產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)方式也發(fā)生了改變，為確保甘蔗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和食糖安全，迫切需要利用基因工程技術(shù)培育和發(fā)展抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗新品種。利用基因工程技術(shù)將殺蟲蛋白基因?qū)胫参镏刑岣咧参锏目瓜x性，已成為當(dāng)今植物基因工程的研究熱點之一。目前轉(zhuǎn)基因甘蔗的技術(shù)已成熟，已有許多獲得轉(zhuǎn)基因植株的報道[2-8]。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲具有髙度特異性，是目前應(yīng)用最廣泛的抗蟲基因[9]。1997年，Arencibia等[10-11]首次將經(jīng)過修飾的Cry1A（b）基因?qū)敫收岵@得了表達。2006年Weng等[12]為提高m-Cry1Ac的表達，對基因進行了密碼子的改造，并將其GC含量提高到47.5%，在Ubi啟動子驅(qū)動下導(dǎo)入甘蔗YT79-177和ROC16，經(jīng)免疫分析確定，有18個轉(zhuǎn)基因株系表達，飼喂于甘蔗蛀莖蟲，1周內(nèi)全部死亡，而對照品種的葉莖則遭受嚴重蟲害。之后Weng[13]再次將GC含量提高到54.8%，再一次提高了Cry1Ac基因的表達量，達到了2.2～50 ng/mg。馮翠蓮等[14-15]構(gòu)建了Cry1Ab和Cry1A（c）基因的植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘蔗，均獲得了陽性植株。

豇豆胰蛋白酶抑制劑（Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI）來自豇豆的可食用部分，其抗蟲譜廣、對人畜無副作用及昆蟲不易產(chǎn)生耐受性，是繼Bt基因之后應(yīng)用較廣的抗蟲基因。CpTI基因已被轉(zhuǎn)到煙草、水稻、棉花等許多作物中。1997年澳大利亞Nutt等[16]、2001年Braga等[17]分別將馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因和Bt基因轉(zhuǎn)入甘蔗，獲得了對蠐螬及螟蟲具有抗性的植株。2003年，F(xiàn)alco[18]將大豆孔尼茲胰島素抑制劑（SKTI）和包曼-布瑞克抑制劑（SBBI）基因?qū)敫收峄蚪M并得到表達，獲得了在一定程度上抵抗甘蔗鉆心蟲的轉(zhuǎn)基因植株，但田間抗性不甚理想，鉆心蟲仍能對其產(chǎn)生危害。而修飾的cpti基因被導(dǎo)入水稻、棉花植株獲得了很好的抗蟲性[19，20]，實驗證明轉(zhuǎn)修飾cpti基因的植物無論是抗蟲蛋白含量還是抗蟲能力均比轉(zhuǎn)野生型cpti基因植物有顯著的提高[21]。Christy等[22]2009年將抑制甘蔗螟蟲生長的抑肽酶合成基因?qū)敫收嶂校?jīng)測定轉(zhuǎn)基因甘蔗的抑肽酶水平發(fā)生變化，在生測試驗中，喂食了轉(zhuǎn)基因甘蔗的螟蟲幼蟲重量顯著降低，其生長發(fā)育受到嚴重影響。2010年，Arvinth等[23]將經(jīng)過密碼子改造的Cry1Ab基因單個導(dǎo)入已轉(zhuǎn)胰蛋白酶抑制劑基因的甘蔗中，在雙基因的轉(zhuǎn)基因甘蔗中其枯心率比轉(zhuǎn)Cry1Ab單基因植株更低，表明Cry1Ab基因與抑制劑基因在轉(zhuǎn)基因甘蔗中存在協(xié)同效應(yīng)。

本研究以甘蔗品種ROC22為轉(zhuǎn)化受體，潮霉素為篩選標記，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙價抗蟲基因，即修飾的蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因（Cry1Ac）和修飾的豇豆蛋白酶抑制基因（sck）導(dǎo)入甘蔗，獲得高效廣譜的抗蟲甘蔗新品系。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗材料為新臺糖22（ROC22），采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所所內(nèi)基地。植物表達載體pCDMARUBAC-Hpt由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾千春研究員提供，農(nóng)桿菌菌株EHA105為本實驗室保存。

pCDMARUBAC-Hpt含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Hpt）、修飾的豇豆胰蛋白酶抑制基因（sck）及修飾的蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因（Cry1Ac），篩選標記和抗蟲基因分別置于2個獨立的T-DNA區(qū)（圖1）。

Taq DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、凝膠回收試劑盒、Marker均購自TaKaRa公司；卡那霉素（Kan）、鏈霉素（Str）、羥芐青霉素（Car）、利福平（Rif）等購自Sigma公司，PCR引物合成和測序由上海生物工程服務(wù)有限公司完成。RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司，地高辛標記與檢測試劑盒購自Roche公司，其他常用的分子生物學(xué)試劑主要購自上海生物工程服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 利用常規(guī)的CaCl2法制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，再以“凍融法”將植物表達載體pCDMARUBAC-Hpt導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中[24]。

1.2.2 甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化 （1）甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。選擇處于拔節(jié)期生長健壯的甘蔗植株，取頂端莖段，于超凈工作臺中剝?nèi)「收岬挠啄廴~片作為外植體，將其切成1 mm的薄片，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)中，（25±1）℃暗培養(yǎng)約6～8周，每2周轉(zhuǎn)接至新的愈傷繼代培養(yǎng)基中，獲得胚性愈傷組織。

（2）農(nóng)桿菌的活化。將含有pCDMARUBAC-Hpt的EHA105菌種涂板于三抗（含有Kan 50 μg/mL，Str 50 μg/mL，Rif 50 μg/mL）YEP固體培養(yǎng)基中（28±1）℃暗培養(yǎng)3 d，挑取單菌落于液體三抗YEP培養(yǎng)約18 h。

離心收集菌體并用液體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸，添加150 μmol/L的AS（乙酰丁香酮），（22±1）℃，100 r/min搖動培養(yǎng)2 h，獲得工程菌液。

（3）胚性愈傷組織的預(yù)處理。轉(zhuǎn)化前將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至新鮮繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，置于無菌的濾紙上再吹1～2 h，至組織塊表面干燥，稍有收縮，即可用于浸染試驗。

（4）轉(zhuǎn)化。將組織塊置于農(nóng)桿菌工作菌液中浸泡約30～40 min，期間10 min搖動1次。濾去菌液轉(zhuǎn)移至濾紙上晾干，表面干爽、無水膜時，切成0.3～0.5 cm的小塊。轉(zhuǎn)接至含100 μmol/L的AS固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上，（ 22±1）℃黑暗培養(yǎng)3～4 d。

（5）分化與篩選。將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有Car 200 mg/L，潮霉素10.0 mg/L的分化培養(yǎng)基上，28 ℃弱光照（500～800 lx）下培養(yǎng)3周。轉(zhuǎn)接至叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，依次添加濃度梯度為20.0、30.0、40.0 mg/L的潮霉素，對分化幼苗進行篩選，并培養(yǎng)出叢生芽。再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，獲得轉(zhuǎn)化植株。

1.2.3 轉(zhuǎn)化甘蔗植株DNA的提取及PCR檢測

甘蔗轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA經(jīng)CTAB法小量提取獲得[26]，測定OD230、OD260和OD280的值，記錄OD260/OD230、OD260/OD280和DNA濃度值。根據(jù)不同濃度將DNA稀釋成50～100 ng/μL。同時經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

以總DNA為模板，Cry1Ac、sck基因引物（見表2）擴增目的片段，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 s。以pCDMARUBAC-Hpt質(zhì)粒DNA作正對照，以未轉(zhuǎn)化甘蔗的DNA為負對照，PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析并照相。PCR產(chǎn)物回收連接PMD-18T載體，導(dǎo)入大腸桿菌送華大公司測序。

1.2.4 RT-PCR檢測 取PCR檢測Cry1Ac、sck基因均呈陽性的甘蔗植株為材料，非轉(zhuǎn)化植株葉片作為對照，提取甘蔗總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，Cry1Ac、sck基因引物擴增目的片段，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.2.5 斑點雜交檢測 取RT-PCR呈陽性的甘蔗轉(zhuǎn)化植株總DNA 50 μg，回收Cry1Ac基因擴增產(chǎn)物，連接PMD-18T載體并測序鑒定，酶切產(chǎn)物進行地高辛標記，于尼龍膜上進行斑點雜交，斑點雜交方法參照Roche 公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ試劑盒說明書，質(zhì)粒pCDMARUBAC-Hpt作為正對照，非轉(zhuǎn)化植株作為負對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

將植物表達載體pCDMARUBAC-Hpt轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，通過單菌落培養(yǎng)和PCR檢測證明其已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌中（圖2）。

2.2 甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和抗性篩選

甘蔗的幼嫩葉片于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)中培養(yǎng)6～8周，繼代培養(yǎng)2次，獲得黃白色、表面高低不平呈顆粒狀突起、質(zhì)地較松脆的顆粒狀愈傷組織（圖3），此類愈傷組織即為胚性愈傷組織，適合用于轉(zhuǎn)化。

采用梯度濃度對轉(zhuǎn)化植株進行篩選，依次添加濃度梯度為10.0、20.0、30.0、40.0 mg/L的潮霉素，獲得抗性植株（圖3）通過生根培養(yǎng)后煉苗移栽沙床。

2.3 甘蔗總DNA的提取

提取甘蔗抗性植株總DNA，所得DNA的A260/A280值處于1.785～1.918之間，A260/A230處于1.934～2.330之間，說明DNA質(zhì)量較高，酚類物質(zhì)、色素、鹽和小分子物質(zhì)等雜質(zhì)較少，電泳結(jié)果見圖4。

2.4 PCR檢測

提取95株甘蔗抗性植株總DNA，通過Cry1Ac、sck基因引物進行PCR擴增，有35株能擴增到與目的基因大小一致的條帶，其中2個基因均擴增出目的條帶的有13株，只擴增出Cry1Ac基因的有16株，只擴增出sck基因的有6株。PCR產(chǎn)物回收測序并通過DNA man比對，結(jié)果顯示與目的基因序列同源性均達100%，初步證明外源基因已整合到甘蔗的基因組中（PCR結(jié)果見圖5、6）。

2.5 RNA的小量提取和RT-PCR檢測

利用Omega RNA提取試劑盒對PCR陽性甘蔗植株及對照甘蔗植株進行RNA的小量提取，部分結(jié)果見圖7。

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用上述引物擴增Cry1Ac、sck基因片段，PCR擴增獲得了目的條帶（部分結(jié)果見圖8、9）。結(jié)果表明，13株P(guān)CR呈陽性的甘蔗中，Cry1Ac、sck基因均在轉(zhuǎn)錄水平上獲得表達。

2.6 斑點雜交

提取了13株P(guān)T-PCR陽性甘蔗植株的DNA進行斑點雜交，結(jié)果有4株呈陽性（圖10），表明Cry1Ac基因已整合到甘蔗基因組中。

3 討論與結(jié)論

以CpTI為代表的植物蛋白酶抑制劑基因抗蟲機理不同于Bt基因，它對鱗翅目、鞘翹目和直翅目的許多害蟲都有明顯的抑制作用，但其殺蟲強度不及Bt基因。為了進一步提高轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲性和擴大其抗蟲譜，將2個及2個以上的抗蟲基因同時導(dǎo)入植物已成為抗蟲分子育種的重要策略。目前報道的使用2個或以上抗蟲基因同時轉(zhuǎn)化甘蔗的研究相對較少[27-28]。

植物表達載體pCDMARUBAC-Hpt含雙T-DNA（transfer DNA）雙抗蟲基因，其中篩選標記基因Hpt在一個T-DNA區(qū)，2個抗蟲基因在另一個T-DNA區(qū)。目標基因CpTI基因進行了5′添加信號肽、3′添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號（signal-cpti-KDEL，簡稱sck） 修飾。為了應(yīng)對基因沉默，克服轉(zhuǎn)基因的位置效應(yīng)，在目標基因表達盒的兩側(cè)分別融合玉米核基質(zhì)結(jié)合序列（Matrix Attachment Region， 簡稱MAR），最終形成MAR-抗蟲基因表達盒-MAR結(jié)構(gòu)。期望利用這2個抗蟲機理和抗蟲譜不同基因間的優(yōu)勢互補，獲得高效廣譜的抗蟲甘蔗新品系，有效延長轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗蟲年限。

本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗品種ROC22獲得潮霉素抗性植株95株。其中，35個能檢測到外源抗蟲基因，通過PCR和RT-PCR檢測有13株雙基因均呈陽性，對13株甘蔗植株進行斑點雜交，有4株呈陽性。同時也開展了轉(zhuǎn)基因甘蔗農(nóng)藝性狀、抗蟲性以及遺傳穩(wěn)定相關(guān)研究（另文發(fā)表）。

參考文獻

[1] 譚裕模， 卓 寧， 黎煥光， 等. 崇左蔗區(qū)螟蟲為害造成產(chǎn)量和糖分損失及生防效果[J].甘蔗糖業(yè)， 2011， 4： 18- 25.

[2] Arencibia A D， Carmona E R， Tellez P， et al. An efficient protocol for sugarcane（Saccharum spp.L.）transformation mediated by Agrobacterium Tumefaciens[J]. Transgenic Res， 1998， 7： 213-222.

[3] Bower R， Birch R G. Transgenic sugarcane plants via microprojectile bombardment[J]. Plant J， 1992， 2： 409-416.

[4] Brumbley S M， Snyman S J， Gnanasambandam A， et al. Sugarcane[M]. Oxford： Blackwell， 2008： 1-58.

[5] Elliott A R， Campbell J A， Brettell R I S， et al. Agrobacterium-mediated transformation of sugarcane using GFP as a screenable maker[J]. Aust J Plant Plant Physiol， 1998， 25： 739-743.

[6] Enriquez-Obregon G A， Vazquez-Padron R I， Prieto-Samsonov D L， et al. Herbicide-resistant sugarcane（Saccharum officinarum L.）plants by Agrobacterium-mediated transformation[J]. Planta， 1998， 206： 20-27.

[7] Manickavasagam M， Ganapathi A， Anbazhagan V R， et al.Agrobacterium-mediated genetic transformation and development of berbicide-resistant sugarcane（Saccharum species hybrids）using axillary buds[J]. Plant Cell Rep， 2004， 23： 134-143.

[8] Zhangsun D， Luo S， Chen R， et al. Improved agrobacterium-mediated genetic transformation of GNA transgenic sugarcane[J]. Biologia， 2007， 62： 386-393.

[9] 孟志剛. Bt殺蟲基因的結(jié)構(gòu)改造與功能研究[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2012.

[10] Arencibia A， Vázquez R I， Prieto D， et al. Transgenic sugarcane plants resistant to stem borer attack[J]. Mol Breed， 1997， 3： 247-255.

[11] Arencibia A D， Carmona E R， Cornide M T， et al. Somaclonal variation in insect-resistant transgenic sugarcane（Saccharum hybrid）plants produced by cell electroporation[J]. Transgenic Res， 1999， 8 ： 349-360.

[12] Weng LX， Dend H， Xu J L， et al. Regeneration of sugarcane elite breeding lines and engineering of stem borer resistance[J]. Pest Management Science， 2006， 62（2）： 178-187.

[13] Weng L X， Deng H H， Xu J L， et al. Transgenic sugarcane plants expressing high levels of modified Cry1Ac provide effective control against stem borers in field trials[J]. Transgenic Res， 2011， 20： 759-772.

[14] 馮翠蓮， 沈林波， 趙婷婷， 等. Cry1Ab基因轉(zhuǎn)化甘蔗及轉(zhuǎn)基因抗蟲植株的獲得[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 31（9）： 21-26.

[15] 馮翠蓮， 劉曉娜， 張樹珍， 等. Cry1A（c）基因植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因甘蔗的獲得[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2010， 3（1）： 1 103-1 108.

[16] Nutt K A， Allsopp P G， McGhie T K， et al. Transgenic sugarcane with increased resistance to canegrubs[C]. In： Proceedings of conference of the Australian Society of Sugarcane Technologists， Townsville， Bresbane， l997.

[17] Braga D P V， Arrigoni E D B， Burnquist W L， et al. A new approach for control of Diatreasaccharalis（Lepidoptera： Crambidae）through the expression of an insecticidal Cry1A（b）protein in transgenic sugarcane[C]//International Society of Sugar Cane Technologists. Proceedings of the XXIV Congress， Australian Society of Sugarcane Technologists， Brisbane， Australia， 2001.

[18] Falco M C， Silva-Filho M C. Expression of soybean proteinase inhibitors in transgenic sugarcane plants： effects on natural defense against Diatraeasaccharalis[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2003， 41（8）： 761-766.

[19] 徐鴻林， 翟紅利， 王 鋒， 等. 豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（cpti）及其在抗蟲轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報， 2008， 10（1）： 18-27.

[20] 郭金英， 朱協(xié)飛， 郭旺珍， 等. 轉(zhuǎn)Bt+sck基因雙價抗蟲棉的抗蟲性及遺傳分析[J]. 棉花學(xué)報， 2007， 19（2）： 88-92.

[21] 朱 禎. 高效抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的研究與開發(fā)[J].中國科學(xué)院院刊， 2001， 16（5）： 353-357.

[22] Christy L A， Aravith S， Saravanakumar M， et al. Engineering sugarcane cultivars with bovine pancreatic trypsin inhibito（raprotinin）gene for protection against top bore（rScirpophagaexcerptalis Walker）[J]. Plant Cell Rep， 2009， 28 ： 175-184.

[23] Arvinth S， Arun S， Selvakesavan R K， et al. Genetic transformation and pyramiding of aprotinin-expressing sugarcane with cry1Ab for shoot bore（rChiloinfuscatellus）resistance[J]. Plant Cell Rep， 2010， 29（4）： 383-395.

[24] 羅遵喜， 楊志才， 呂蘇珊， 等. 美洲商陸抗病毒蛋白基因遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗的研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2009， 30（11）： 1 646-1 650.

[25] Murashige T ， Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Plant Physiol， 1962， 15： 473-497.

[26] 吳轉(zhuǎn)娣， 昝逢剛， 趙麗宏， 等. 甘蔗基因組DNA小量提取與大量提取方法研究[J]. 生物技術(shù)通報， 2009， S1： 172-175.

[27] Falco M C， Silva-Filho M C. Expression of soybean proteinaseinhibitors in transgenic sugarcane plants： effects onnatural defense against Diatraeasaccharalis[J]. Plant Physiologyand Biochemistry， 2003， 41（8）： 761-766.

[28] 鄧智年， 魏源文， 黃誠梅， 等. 融合殺蟲基因?qū)Ω收岬倪z傳轉(zhuǎn)化[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2012， 43（8）： 1 086-1 089.