桑慶亮等
摘 要 以幼胚來(lái)源的荔枝EC作為受體材料,采用基因槍轟擊的方法將外源gus基因轉(zhuǎn)入荔枝,并對(duì)不同條件下的GUS瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行了詳細(xì)研究。結(jié)果表明:在其它參數(shù)不變的條件下,轟擊距離、真空度、可裂膜片壓力、金粉用量、質(zhì)粒DNA用量等理化參數(shù)顯著影響GUS瞬時(shí)表達(dá);滲透處理可顯著促進(jìn)GUS瞬時(shí)表達(dá)。因此,荔枝EC基因槍轉(zhuǎn)化的適宜條件為在轟擊距離6 cm、真空度84.66 kPa、可裂膜片壓力7 584.23 kPa、轟擊1次的情況下,每次轟擊用1 μg質(zhì)粒DNA包裹600 μg金粉對(duì)事先用0.25 mol/L前處理4 h的荔枝EC轟擊,并在轟擊后滲透處理20 h。另外,經(jīng)50 mg/L潮霉素篩選得到荔枝抗性愈傷組織,并通過(guò)體胚發(fā)生途徑獲再生植株,且GUS染色顯示獲得了穩(wěn)定表達(dá)GUS蛋白的細(xì)胞系和植株。
關(guān)鍵詞 荔枝;胚性愈傷組織;基因槍;遺傳轉(zhuǎn)化;瞬時(shí)表達(dá)
中圖分類號(hào) S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A
Abstract In the paper, plasmid pCAMBIA1301 DNA harboring the gus gene encoding β-glucuronidase, coated on gold particles, was delivered into cultured EC via particle bombardment and transformation was monitored by analyzing GUS transient expression in Litchi chinensis Sonn. The results showed that GUS transient expression level was significantly influenced by physical and chemical factors, such as distance to targets, vocuum pressure, helium pressure, gold particle dosage, plasmid DNA dosage, and vitality of litchi EC cells, which affected by growth stages and osmatic treatment. A suitable particle bombardment procedure was proposed. Litchi EC which was pre-cultured on MS medium with 0.25 mol/L mannitol for 4 hours and post-cultured for 20 hours after bombardment was bombarded once using 600 μg gold particles coated with 1 μg plasmid DNA with a vacuum degree of 84.66 kPa, a bombarded distance of 6 cm, and a rupture disk value of 7 584.23 kPa. Hygromycin-resistant embryonic calli(HREC)and plantlets regenerated from HREC were also obtained and GUS stable expression in HREC and leaves were also examined to confirm transformation.
Key words Litchi chinensis Sonn.; Embryonic calli; Particle bombardment; Genetic transformation; Transient expression
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.021
荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是重要的熱帶亞熱帶木本果樹(shù),主要分布于中國(guó)福建、廣東、廣西、云南、四川等省以及世界上許多熱帶亞熱帶地區(qū),經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。由于荔枝是多年生的木本植物,遺傳背景復(fù)雜,傳統(tǒng)遺傳育種進(jìn)展緩慢?,F(xiàn)代植物組織培養(yǎng)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起與發(fā)展為加速荔枝品種改良提供了強(qiáng)有利的手段。
荔枝組織培養(yǎng)技術(shù)的研究始于20世紀(jì)80年代。1983年,傅蓮芳和唐道一[1]首先從荔枝花粉培養(yǎng)獲得再生植株。此后,呂柳新等[2]、周麗儂等[3]均通過(guò)荔枝幼胚培養(yǎng)獲得再生植株。1997年,俞長(zhǎng)河[4]進(jìn)行了荔枝原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)的工作,并通過(guò)體胚發(fā)生途徑獲得再生植株。2000年,Lai等[5-6]對(duì)龍眼、荔枝組織培養(yǎng)和體胚發(fā)生進(jìn)行了總結(jié),至此,荔枝再生體系基本確立。歐陽(yáng)曙等[7]曾用注射器將根癌農(nóng)桿菌荔枝初生苗與結(jié)果樹(shù)枝條上,經(jīng)培養(yǎng)獲得了愈傷組織,初步證明了T-DNA可用作荔枝基因工程的載體。此后,曾黎輝等[8]均通過(guò)農(nóng)桿菌感染的方式獲得了GUS瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果;Puchooa[9]將GFP基因通過(guò)農(nóng)桿菌感染的方法轉(zhuǎn)入荔枝愈傷組織和葉片,但未獲得再生植株,Das等[10]通過(guò)農(nóng)桿菌感染的方式將水稻幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入荔枝EC獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。這些采用農(nóng)桿菌對(duì)荔枝進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究均出現(xiàn)效率低,轉(zhuǎn)化體系不完善。基因槍法技術(shù)具有2大優(yōu)點(diǎn)[11]:無(wú)宿主限制、靶受體類型廣泛,為建立高效荔枝遺傳轉(zhuǎn)化提供有效途徑。為此,在對(duì)荔枝EC進(jìn)行基因槍轟擊后,獲得了GUS瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果[12]。
本研究在初步基因槍轟擊試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)影響荔枝胚性愈傷組織(Embryonic calli, EC)轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了試驗(yàn),以優(yōu)化轟擊條件,并篩選得到抗性EC,建立起比較穩(wěn)定的荔枝轉(zhuǎn)化體系,為荔枝遺傳改良奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
供試受體材料為由荔枝晚熟優(yōu)良品種“下番枝”的幼胚誘導(dǎo)并長(zhǎng)期繼代的松散型EC。供試質(zhì)粒為帶有潮霉素抗性基因(hpt)和β-葡萄糖醛酸酶基因(gus)的載體pCAMBIA1301(由福建省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王鋒博士提供)。
1.2 方法
1.2.1 質(zhì)粒DNA提取與純化 質(zhì)粒DNA提取參照Green等[13]的方法,純化后的質(zhì)粒DNA在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 受體材料的預(yù)處理 轟擊試驗(yàn)前5~10 d,將旺盛生長(zhǎng)的荔枝EC接種到附加1 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基上于(25±2)℃、光照條件下預(yù)培養(yǎng)。轟擊前4~8 h將荔枝EC轉(zhuǎn)移到含有甘露醇的滲透培養(yǎng)基上進(jìn)行滲透處理。
1.2.3 轟擊程序 操作采用BioRad PDS-1000/He型基因槍完成。試驗(yàn)CaCl2濃度(2.5 mol/L)、亞精胺濃度(0.1 mol/L)、金粉直徑(1 μl)等參數(shù)均固定,按儀器使用說(shuō)明準(zhǔn)備金粉和制備微彈?;巨Z擊參數(shù)如下,即真空度84.66 kPa、轟擊距離6 cm、可裂膜片壓力7 584.23 kPa、每次轟擊金粉用量600 μg、每次轟擊質(zhì)粒DNA用量1 μg,0.5 mol/L的甘露醇前處理4 h,后處理16 h,轟擊1次。
1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在其他參數(shù)固定的情況下,以單因素試驗(yàn)分析了理化因素如轟擊次數(shù)(1、2、3次)、真空度(50.80、67.73、84.66、91.43 kPa)、轟擊距離(3、6、9 cm)、可裂膜片壓力(6 205.28、7 584.23、8 963.18 kPa)、每次轟擊金粉用量(60、150、300、600、1 200 μg)每次轟擊質(zhì)粒DNA用量(0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 μg)和與荔枝EC生理活性有關(guān)的因素如恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間(1 h、2 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、14 d和21 d)、滲透處理所用甘露醇濃度(0.000、0.125、0.250、0.500、0.750 mol/L)、滲透前處理時(shí)間(0、2、4、6、8 h)以及滲透后處理時(shí)間(0、16、20、24 h)對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)的影響。每次轟擊均設(shè)不含質(zhì)粒DNA對(duì)照。
1.2.5 GUS瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè) 參照J(rèn)efferson等[14]的方法并稍作改動(dòng)。待染色荔枝材料(EC、葉片等)轉(zhuǎn)入適量X-Gluc染色液(1 mg/mL X-Gluc,5 mmol/L的鐵氰化鉀和5 mmol/L亞鐵氰化鉀,0.1% Triton X-100,用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液定容)中,置于37 ℃黑暗條件下保溫12 h,于解剖鏡下觀察記錄藍(lán)斑數(shù)。以一次轟擊所有的愈傷組織作為一個(gè)GUS瞬時(shí)表達(dá)單位(Transient Expression Unit,TEU),則GUS瞬時(shí)表達(dá)水平(Transient Expression Level,TEL)表示為藍(lán)斑數(shù)/TEU。
1.2.6 抗性愈傷組織篩選與再生植株 荔枝抗性EC的篩選采用在含50 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)的方式;再生植株經(jīng)由體胚發(fā)生途徑,采用在含有5 mg/L玉米素和5%蔗糖的MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)的方式;體胚在無(wú)激素含5%蔗糖的MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)以獲得成熟體胚;成熟體胚轉(zhuǎn)至含2%蔗糖的MS培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)使體胚萌發(fā)成苗。
2 結(jié)果與分析
2.1 轟擊物理參數(shù)對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)的影響
2.1.1 轟擊次數(shù) 轟擊次數(shù)影響受體細(xì)胞受損程度,本研究試驗(yàn)了1、2和3次轟擊后GUS瞬時(shí)表達(dá)情況(圖1)。結(jié)果表明,隨轟擊次數(shù)增加,GUS瞬時(shí)表達(dá)水平上升,但轟擊次數(shù)對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)水平的影響不顯著(ANOVA,p>0.05)。
2.1.2 真空度 GUS瞬時(shí)表達(dá)水平隨真空度提高而提高(圖2),且差異顯著(ANOVA,p<0.05)。其中,真空度為84.66、91.43 kPa時(shí),GUS瞬時(shí)表達(dá)水平相差不大[分別為(1 532.00±168.94)個(gè)藍(lán)斑/TEU和(1 544.33±115.94)個(gè)藍(lán)斑/TEU],而50.80 kPa時(shí),GUS瞬時(shí)表達(dá)水平最低[(5.67±3.06)個(gè)藍(lán)斑/TEU]。
2.1.3 轟擊距離 轟擊距離對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)的影響表現(xiàn)為先增大后降低的趨勢(shì)(圖3),且差異顯著(ANOVA,p<0.05)。其中,轟擊距離6 cm時(shí),GUS瞬時(shí)表達(dá)水平最高[(1 150.00±201.10)個(gè)藍(lán)斑/TEU],9 cm時(shí)GUS瞬時(shí)表達(dá)水平最低[(93.33±12.74)個(gè)藍(lán)斑/TEU]。多重比較結(jié)果表明,兩兩轟擊距離間差異顯著。
2.1.4 可裂膜片壓力 可裂膜片壓力顯著影響GUS瞬時(shí)表達(dá)水平(ANOVA,p<0.05),且總體上壓力越大GUS瞬時(shí)表達(dá)水平越高(圖4)。其中,7 584.23 kPa的壓力下,GUS瞬時(shí)表達(dá)水平最高[(1 876.33±105.46)個(gè)藍(lán)斑/TEU],8 963.18 kPa的壓力下次之[(1 535±71.08)個(gè)藍(lán)斑/TEU],6 205.28 kPa壓力時(shí)最低[(145.67±13.05)個(gè)藍(lán)斑/TEU]。多重比較發(fā)現(xiàn),3種壓力兩兩之間GUS瞬時(shí)表達(dá)的差異均顯著。
2.1.5 每次轟擊金粉用量 金粉用量對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)的影響也表現(xiàn)為先增高后下降的趨勢(shì)(圖5),且差異顯著(ANOVA,p<0.05)。其中,金粉用量600 μg時(shí)GUS瞬時(shí)表達(dá)最強(qiáng)[(2 426.00±553.26)個(gè)藍(lán)斑/TEU],而每次轟擊60 μg金粉時(shí)GUS瞬時(shí)表達(dá)最差[(340.00±80.62)個(gè)藍(lán)斑/TEU]。但多重比較結(jié)果表明,金粉用量300~1 200 μg之間,GUS瞬時(shí)表達(dá)兩兩之間并無(wú)明顯差異。
2.1.6 每次轟擊質(zhì)粒DNA用量 質(zhì)粒DNA用量對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)的影響表現(xiàn)為先提高后下降的趨勢(shì)(圖6),且差異顯著(ANOVA,p<0.05)。其中,質(zhì)粒用量0.5 μg時(shí),GUS瞬時(shí)表達(dá)水平最高[(2 159±249.51)個(gè)藍(lán)斑/TEU],無(wú)質(zhì)粒DNA時(shí)無(wú)GUS表達(dá)(圖11-A和B)。多重比較發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒用量0.2~1.5 μg范圍內(nèi),GUS瞬時(shí)表達(dá)的差異不顯著。
2.2 生理因素對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)的影響
2.2.1 恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間 GUS瞬時(shí)表達(dá)水平隨恢復(fù)培養(yǎng)延長(zhǎng)而逐漸下降(圖7),且差異顯著(ANOVA,p<0.05)。轟擊后1~2 h,GUS無(wú)瞬時(shí)表達(dá)(檢測(cè)到0個(gè)藍(lán)斑/TEU);1 d左右,GUS瞬時(shí)表達(dá)水平最高[(1 462±116.38)個(gè)藍(lán)斑/TEU],隨后GUS活性逐漸衰退,到7 d時(shí)已經(jīng)很微弱[(96±10.71)個(gè)藍(lán)斑/TEU];14、21 d,藍(lán)斑數(shù)極少[分別為(16.67±2.62)、(6.33±1.70)個(gè)藍(lán)斑/TEU]。多重比較結(jié)果也表明,轟擊后1 d顯著高于2~21 d時(shí)。
2.2.2 甘露醇濃度 隨甘露醇濃度增高,GUS瞬時(shí)表達(dá)水平呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖8),且差異顯著(ANOVA,p<0.05)。其中,0.25 mol/L的甘露醇,GUS瞬時(shí)表達(dá)水平最高[(1 576.67±131.79)個(gè)藍(lán)斑/TEU],未經(jīng)甘露醇處理的荔枝EC中GUS瞬時(shí)表達(dá)水平最低[(31.67±6.11)個(gè)藍(lán)斑/TEU],表明甘露醇處理是影響基因槍轟擊后GUS瞬時(shí)表達(dá)的重要因素。
2.2.3 滲透前處理時(shí)間 其它轟擊條件固定,以0.25 mol/L的甘露醇作為滲透劑,隨滲透前處理時(shí)間增加,GUS瞬時(shí)表達(dá)水平呈先增高后下降的趨勢(shì)(圖9),但差異不顯著(ANOVA,p>0.05)。其中,4 h前處理,GUS瞬時(shí)表達(dá)最高[(1 155.33±274.38)個(gè)藍(lán)斑/TEU],未進(jìn)行前處理,則GUS瞬時(shí)表達(dá)水平最低[(760.00±143.06)個(gè)藍(lán)斑/TEU]。
2.2.4 滲透后處理時(shí)間 固定甘露醇濃度為0.25 mol/L,滲透后處理可明顯促進(jìn)GUS瞬時(shí)表達(dá)(圖10),且差異顯著(ANOVA,p<0.05)。多重比較結(jié)果顯示,無(wú)滲透后處理,則GUS瞬時(shí)表達(dá)水平[(430.33±74.85)個(gè)藍(lán)斑/TEU]顯著低于有滲透后處理的GUS瞬時(shí)表達(dá)水平,而后處理16、20、24 h的荔枝EC中GUS瞬時(shí)表達(dá)水平無(wú)顯著差異。
2.3 抗性EC篩選與再生植株
經(jīng)50 mg/L潮霉素篩選3個(gè)月,得到荔枝抗性愈傷組織(Hygromycin-resistant embryonic calli,HREC),取少量HREC于X-Gluc染色液中浸泡,穩(wěn)定顯藍(lán)色(圖11-C);置于倒置顯微鏡下可觀察,發(fā)現(xiàn)HREC內(nèi)部被染成藍(lán)色的組織(圖11-D),表明荔枝HREC可穩(wěn)定地表達(dá)GUS蛋白,即本研究通過(guò)基因槍轟擊的方法獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。
在含有5 mg/L玉米素和5%蔗糖的MS培養(yǎng)基上,暗培養(yǎng)約1個(gè)月即可得到大量白色體胚。將白色體胚在含10%椰子汁和5%蔗糖的MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng),經(jīng)2~3個(gè)月暗培養(yǎng),得到了直徑0.5~1.0 cm的成熟體胚。轉(zhuǎn)入無(wú)激素MS培養(yǎng)基上,光照培養(yǎng)1~2個(gè)月得到了荔枝抗性EC的再生植株(圖11-E)。將再生植株的葉片切成細(xì)小條狀進(jìn)行GUS活性檢測(cè),切口明顯染成藍(lán)色,可以初步確定為轉(zhuǎn)基因植株(圖11-F)。
3 討論與結(jié)論
3.1 優(yōu)化理化因素可以明顯提高轉(zhuǎn)化效率
各理化因素影響轉(zhuǎn)化效率的機(jī)制是對(duì)轟擊強(qiáng)度與細(xì)胞損傷程度這對(duì)矛盾的權(quán)衡中實(shí)現(xiàn)的。一方面,提高真空度、縮短轟擊距離、提高可裂膜片壓力會(huì)提高微彈的速度,能有效地將外源DNA送達(dá)準(zhǔn)確的位置;另一方面,轟擊強(qiáng)度增加必然帶來(lái)生物材料受損程度提高,隨轟擊后時(shí)間的延長(zhǎng),大量細(xì)胞死亡,造成GUS瞬時(shí)表達(dá)水平下降。反之,如果真空度下降、可裂膜片壓力下降,GUS瞬時(shí)表達(dá)水平下降,可能的原因是只有少量外源DNA能夠到達(dá)準(zhǔn)確位置。
本研究發(fā)現(xiàn)轟擊距離、可裂膜片類型、DNA用量、金粉用量、真空度等理化因素均顯著影響GUS瞬時(shí)表達(dá)水平,而轟擊次數(shù)、對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)影響不大。這些理化因素的水平通過(guò)影響受體材料的生理狀態(tài)來(lái)影響GUS瞬時(shí)表達(dá)水平。Rasco-Gaunt等[15]認(rèn)為較低壓力下,金粉分散面積大且均勻,對(duì)細(xì)胞傷害小,而高壓力下金粉分散面積小且對(duì)細(xì)胞傷害大,造成GUS瞬時(shí)表達(dá)水平下降且不均一。
本研究中還發(fā)現(xiàn),相對(duì)較強(qiáng)的轟擊條件(比如更高的真空度)對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)有利,這一結(jié)論與Folling等[16]的看法相似。
3.2 改善受體材料的生理活性有助于提高轉(zhuǎn)化效率
一般認(rèn)為生理活性高的組織或細(xì)胞,其DNA活躍,有利于外源DNA的攝入與融合,且受體細(xì)胞DNA的活躍程度與滲透壓有關(guān)。已有研究證實(shí),滲透處理可增強(qiáng)瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)水平[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn),甘露醇滲透處理使荔枝EC轟擊后GUS瞬時(shí)表達(dá)水平顯著提高,證實(shí)了上述說(shuō)法。
滲透處理提高轉(zhuǎn)化效率的可能原因:前處理可能使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離,轟擊時(shí)原生質(zhì)體免受損傷[17];后處理則為受損細(xì)胞提供有利的膜修復(fù)環(huán)境,促進(jìn)受損細(xì)胞恢復(fù)。但是,本研究中高濃度甘露醇(0.5 mol/L和0.75 mol/L)處理的效果均較較低濃度甘露醇(0.25 mol/L)處理的效果差,且滲透處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)GUS瞬時(shí)表達(dá)水平也會(huì)下降,表明滲透處理時(shí)間以及滲透劑濃度是非常重要的,如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高,同樣會(huì)對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生較大的影響,從而影響其活力,進(jìn)而影響其遺傳轉(zhuǎn)化。
3.3 荔枝EC基因槍轉(zhuǎn)化的意義
3.3.1 荔枝HREC是很好的細(xì)胞學(xué)研究材料 細(xì)胞生物學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)研究中,細(xì)胞融合是非常有用的技術(shù)手段,但近緣物種之間由于基因組存在很大的相似性,以自身基因或DNA序列作為鑒定標(biāo)記難以區(qū)分,利用報(bào)告基因進(jìn)行鑒定是可行的。如黃枝英等[20]利用本研究得到的HREC分離原生質(zhì)體并高頻獲得再生植株,黃淺[21]用上述原生質(zhì)體細(xì)胞系與龍眼進(jìn)行細(xì)胞融合試驗(yàn)。
3.3.2 穩(wěn)定的瞬時(shí)表達(dá)體系為基因功能研究提供重要手段 瞬時(shí)表達(dá)分析是對(duì)基因產(chǎn)物的功能進(jìn)行分析時(shí)不可或缺的重要手段。雖然在植物中,農(nóng)桿菌可以用于許多物種的瞬時(shí)表達(dá)分析,但是對(duì)于荔枝來(lái)說(shuō),仍然不適用?;驑尲夹g(shù)可以穩(wěn)定地將外源基因?qū)胫参锝M織,并借此研究基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能和亞細(xì)胞定位。這一過(guò)程一般在1周內(nèi)完成[22],因而本研究建立的高效基因槍轉(zhuǎn)化體系在荔枝及近緣種基因功能研究中具重要意義。
3.3.3 拓寬荔枝轉(zhuǎn)基因受體材料的范圍,促進(jìn)荔枝遺傳改良 由于荔枝是多年生木本植物,遺傳背景復(fù)雜,成體的優(yōu)良性狀很難在下一代植株中保持,使用葉、莖尖、側(cè)芽等成體材料意義重大,因此,改進(jìn)組織培養(yǎng)技術(shù)拓寬荔枝轉(zhuǎn)基因受體材料的范圍是促進(jìn)荔枝遺傳改良的基礎(chǔ),近年這方面的研究取得了一定的成果[23-26],但大規(guī)模再生植株仍存在較大困難。一旦再生體系得以建立,利用基因槍法轉(zhuǎn)化荔枝EC的優(yōu)化程序,就有可能在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)轉(zhuǎn)基因方式對(duì)荔枝品種進(jìn)行遺傳改良。
致 謝 本研究的部分內(nèi)容在福建省農(nóng)科院遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成,并得到王鋒博士的大力支持與幫助,謹(jǐn)致謝忱!
參考文獻(xiàn)
[1] 傅蓮芳, 唐道一. 荔枝花粉植株誘導(dǎo)的研究[J]. 遺傳學(xué)報(bào), 1983, 10(5): 369-374.
[2] 呂柳新, 余小玲. 荔枝幼胚的離體培養(yǎng)[J]. 福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1993, 22(4): 410-413.
[3] 周麗儂, 鄺哲師, 馬雪筠, 等. 影響荔枝幼胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生因素的研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 1996(2): 161-165.
[4] 俞長(zhǎng)河. 荔枝原生質(zhì)體培養(yǎng)研究[D]. 福州:福建農(nóng)業(yè)大學(xué), 1997.
[5] Lai Z, Chen C, Zeng L, et al. Somatic embryogenesis in longan[Dimocarpus longan Lour.][J]. Forestry Sciences, 2000(6): 415-432.
[6] Lai Z, Chen C, Chen Z. Progress in biotechnology in longan[J]. Acta Horticulturae, 2000(558): 137-141.
[7] 歐陽(yáng)曙, 鄭曉英, 王瑞珍, 等. 致瘤農(nóng)桿菌對(duì)荔枝的致瘤及T-DNA轉(zhuǎn)移[J]. 遺傳學(xué)報(bào), 1985, 12(1): 42-45.
[8] 曾黎輝, 呂柳新. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)荔枝遺傳轉(zhuǎn)化研究[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2003, 20(4): 287-290.
[9] Puchooa D. Expression of green fluorescent protein gene in litchi(Litchi chinensis Sonn.)tissues[J]. J. Appl. Hort, 2004, 6(1): 11-15.
[10] Das D, Rahman A. Expression of a rice chitinase gene enhances antifungal response in transgenic litchi(cv. Bedana)[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture(PCTOC), 2012, 109(2): 315-325.
[11] 王關(guān)林, 方宏筠. 植物基因工程原理與技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1998.
[12] 桑慶亮, 賴鐘雄, 潘東明. 荔枝基因槍轉(zhuǎn)化研究初報(bào)[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 30(20): 266-267.
[13] Green M R, Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.
[14] Jefferson R A, Kavanagh T A, Bevan M W. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J]. The EMBO Journal, 1987, 6(13): 3 901-3 907.
[15] Rasco-Gaunt S, Riley A, Barcelo P, et al. Analysis of particle bombardment parameters to optimise DNA delivery into wheat tissues[J]. Plant Cell Reports, 1999, 19(2): 118-127.
[16] Folling L, Olesen A. Transformation of wheat(Triticum aestivum L.)microspore-derived callus and microspores by particle bombardment[J]. Plant Cell Reports, 2001, 20(7): 629-636.
[17] Vain P, McMullen M D, Finer J J. Osmotic treatment enhances particle bombardment-mediated transient and stable transformation of maize[J]. Plant Cell Reports, 1993, 12(2): 84-88.
[18] Altpeter F, Vasil V, Srivastava V, et al. Accelerated production of transgenic wheat(Triticum aestivum L.)plants[J]. Plant Cell Reports, 1996, 16(1-2): 12-17.
[19] 王芋華. 水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2004, 10(2): 139-142.
[20] 黃枝英, 賴鐘雄. 荔枝轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織原生質(zhì)體分離條件的優(yōu)化[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2006, 35(3): 266-271.
[21] 黃 淺. 荔枝TPEC高頻率體胚發(fā)生及荔枝與龍眼原生質(zhì)體融合研究[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2008.
[22] Ueki S, Lacroix B, Krichevsky A, et al. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment[J]. Nature protocols, 2008, 4(1): 71-77.
[23] Puchooa D. In vitro regeneration of lychee(Litchi chinensis Sonn.)[J]. African Journal of Biotechnology, 2005, 3(11): 576-584.
[24] 蘇明申, 林順權(quán), 陳振光, 等. 荔枝葉片愈傷組織的誘導(dǎo)[J]. 中國(guó)南方果樹(shù), 2005, 34(1): 25-26.
[25] 范翠娜, 劉國(guó)杰. 荔枝幼葉愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 中國(guó)果樹(shù), 2006(3): 25-27.
[26] Ma X Y, Yi G J, Huang X L, et al. Leaf callus induction and suspension culture establishment in lychee(Litchi chinensis Sonn.)cv. Huaizhi[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2009, 31(2): 401-405.