徐寶興等

摘要

[目的]建立一種發(fā)酵液中核黃素含量的快速測定方法。[方法]利用紫外分光光度法，檢測波長為444 nm。[結(jié)果] 在5.04～25.40 μg/ml之間相關(guān)系數(shù)為0.999 6，回收率為100.736 7%。 [結(jié)論] 該方法簡單、快速、準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞 紫外分光光度法；核黃素；發(fā)酵液

中圖分類號 S182 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03223-02

Abstract [Objective] The research aimed to found a method to determine the concentration of riboflavin in fermentation broth fast. [Method] Using UV spectrophotometry， the determination wavelength was 444 nm. [Result] The coefficient was 0.999 6 in the linearity range from 5.04 μg/ml to 25.4 μg/ml， and the recovery rate was 100.736 7%. [Conclusion] This method was simple， fast and accurate.

Key words UV spectrophotography； Riboflavin； Fermentation broth

核黃素（Riboflavin）即維生素B2（Vitamin B2），是人和動物必需的水溶性維生素，是體內(nèi)多種氧化酶系統(tǒng)中不可缺少的輔基部分。如果機(jī)體缺乏核黃素，那么就會影響生物體正常的氧化作用，引起物質(zhì)代謝紊亂，出現(xiàn)一系列的病癥，可出現(xiàn)口角炎、舌炎等一系列皮膚黏膜癥狀，嚴(yán)重者將會導(dǎo)致死亡[1]。有研究表明，核黃素的缺乏會減弱HepG2細(xì)胞中的氧化折疊及阿樸脂蛋白B100的分泌，引起機(jī)體產(chǎn)生焦慮應(yīng)答[2]。進(jìn)一步研究顯示，缺乏核黃素還會引起HepG2細(xì)胞中蛋白質(zhì)和DNA的損傷，使得細(xì)胞周期停留在G1期[3]。核黃素廣泛存在于動植物中，在酵母、肝、腎、蛋黃、奶及大豆中含量豐富，很多微生物、植物、真菌都能合成核黃素，但是脊柱動物包括人類只能從食物中攝取，因此它被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及飼料等行業(yè)[4-7]?，F(xiàn)在，全世界年產(chǎn)核黃素3 000 t，其中約75%用作飼料添加劑，約25%用于食品和藥品[8]。目前，核黃素的工業(yè)化生產(chǎn)以微生物液態(tài)深層發(fā)酵法為主。生產(chǎn)用的菌種主要有阿氏假囊酵母（Eremothecium ashbyii，簡稱E. ashbyii ）、棉病阿舒囊霉（Ashbya gossypii） 、無名假絲酵母菌（Candida famate）及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[9]?？焖贉y定發(fā)酵液中核黃素的含量對菌種選育、代謝調(diào)控、改進(jìn)發(fā)酵工藝都具有非常重要的意義。筆者對紫外分光光度法快速測定發(fā)酵液中核黃素的含量進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

供試菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis），生物室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1.0%，瓊脂2.0%，pH 7.2～7.4；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，酵母抽提物1.0%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.2～7.4；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10%， MgSO4·7H2O 0.05%，黃豆粉0.35%，玉米槳0.3%，酵母粉0.1%，pH 7.2～7.4。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1

發(fā)酵條件。從冷藏斜面上挑取菌苔，在含有相對應(yīng)抗生素的LB平板上三區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)箱中活化24 h，挑取單菌落接種至裝有50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，37 ℃培養(yǎng)24 h，接種至裝有50 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，使發(fā)酵液中菌體初始濃度為2.5×108 cfu/ml，40 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)50 h，待測。

1.3.2

樣品處理。將發(fā)酵液搖勻，取發(fā)酵液500 μl，加4.5 ml 0.05 mol/L NaOH，8 000 r/min離心4～5 min，除去發(fā)酵液中的菌體和其他雜質(zhì)，所得上清液再用0.01 mol/L HAC適當(dāng)稀釋后即為待測液。

1.3.3

標(biāo)準(zhǔn)溶液。避光操作。精密稱取核黃素對照品50.4 mg，加5 ml 0.05 mol/L NaOH溶解，再用0.01 mol/L HAc定容至100 ml，分別取不同量，用0.01 mol/L HAc稀釋成不同濃度，即5.04、10.08、12.10、15.12、18.14、20.16、25.40 μg/ml，在444 nm下測定吸收值。每個點(diǎn)測定3次，求A（平均）。

1.3.4

參比溶液。以滅菌后的培養(yǎng)基溶液代替發(fā)酵液，同“1.3.2”操作處理后作為空白溶液。

1.3.5

檢測條件。用紫外分光光度計(jì)對標(biāo)準(zhǔn)溶液、發(fā)酵液及未接種培養(yǎng)基進(jìn)行全波長掃描，在444nm處測定發(fā)酵液的吸收峰值。

1.3.6

定量測定。樣品經(jīng)過處理后在444 nm處測定其吸收峰值，根據(jù)444 nm處吸收峰值及所做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液中核黃素提取試劑的確定

根據(jù)核黃素的溶解度與pH的關(guān)系[10]和相關(guān)文獻(xiàn)報道，確定了用0.05 mol/L NaOH提取核黃素。結(jié)果表明，采取該方法可以使得核黃素穩(wěn)定存在的時間滿足試驗(yàn)要求，并且可以充分溶解發(fā)酵液中的核黃素，經(jīng)離心可以方便地除去發(fā)酵液中菌體和其他雜質(zhì)，減少對掃描圖譜的干擾。

2.2 檢測波長的確定

3 討論

核黃素檢測方法有微生物法、紫外分光光度法、直接熒光法、光黃素測定法、高效液相色譜法、磷光法、離子對色譜法、化學(xué)發(fā)光法等[11-14]。微生物法、直接熒光法、光黃素測定法操作比較繁瑣或特異性不夠，不能區(qū)分核黃素及其衍生物；高效液相色譜法、磷光法、 離子對色譜法、化學(xué)發(fā)光法需要特殊儀器，且對人員素質(zhì)要求較高，一般實(shí)驗(yàn)室難以滿足條件；而紫外分光光度法作為實(shí)驗(yàn)室的一種常規(guī)方法，一般實(shí)驗(yàn)室都可開展該工作。建立一種快速、有效的紫外分光光度法測定發(fā)酵液中核黃素含量，對菌種選育、代謝調(diào)控、改進(jìn)發(fā)酵工藝等都具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。該研究介紹的方法簡單、快速、準(zhǔn)確。

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