陳俊男等

[摘要]目的：觀察新西蘭兔注射肉毒毒素后，局部肌肉及神經組織超微結構變化特點，為把A 型肉毒毒素充分利用于臨床實踐提供重要的組織形態(tài)學依據(jù)及指導依據(jù)。方法：選雄性新西蘭白兔32只，隨機分為A組和B組，每組各16只。選擇耳前肌為注射部位，右側耳前肌注射0.05ml（2.5U）注射用 A 型肉毒毒素，其中A組注射新鮮配置好的A型肉毒毒素，B組注射配置后儲存2 周的A型肉毒毒素；左側耳前肌注射等量生理鹽水作為對照。A、B組各隨機分為2組，每組8只，分別于注射后第5天和第12周進行其肌肉組織活檢，對照側同時間點取活檢。行肌肉、神經組織電鏡觀察。結果：肌肉電鏡觀察結果：在注射后早期（第 5天），新鮮及儲存的A型肉毒毒素對肌肉的影響無顯著性差異；在注射后晚期（第12周），新鮮及儲存的A型肉毒毒素比較，兩者造成的肌肉萎縮程度無顯著性差異。神經電鏡觀察結果：A型肉毒毒素注射后神經改變與上述肌肉改變同。結論：通過電鏡觀察注射A型肉毒毒素后的局部肌肉、神經，可以理想地觀察單個目的肌肉及神經的超微結構變化特點，并且發(fā)現(xiàn)儲存2周的A型肉毒毒素與新鮮的A型肉毒毒素比較，兩者效價基本相同，為A型肉毒毒素在臨床開展相關研究及應用提供了新的思路。

[關鍵詞]A型肉毒毒素；超微結構；變性；電鏡

[中圖分類號]R62 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）17-1445-04

Changes of ultrastructure of muscle and nerve in New Zealand white rabbits after injected with botulinum toxin

CHEN Jun-nan1，LI Zhi-hua1，LV Xiao-jie1，HU Xiao-chun1，WANG Yi1，LV Chuan2，SONG Jian-xing2，TIAN Xiao-chen1

（1.Department of Plastic，General Hospital of Second Artillery of PLA，Beijing 100088，China；2.Department of Plastic Surgery，Changhai Hospital，The Second Military Medical University of PLA， Shanghai 200433，China）

Abstract： Objective To observe the ultrastructural changes of muscle and nerve of New Zealand White Rabbits after injected with botulinum toxin in order to provide scientific base of histomorphology for clinical use of botulinum toxin type A. Methods Totally 32 male New Zealand White rabbits were randomized divided into group A（16） and group B（16），and anterior auricular muscle was used for injections. Each right anterior auricular muscle received the injection of 2.5U BTXA， Group A received the injection of freshly reconstituted BTXA while group B received the injection of stored （for 2 weeks）BTXA， and left anterior auricular muscle of the same rabbit with the same amount of saline as controls.Group A（16） were randomized divided into two groups which included 8 rabbits each.Group B（16） were randomized divided into two groups which included 8 rabbits each.Muscles and motor nerves were harvested at 5 days （early period） and 12 weeks （late period） respectively after BTXA injection， and left anterior auricular muscle was separated for histological analysis.Alterations in muscle and nerve ultrastructure were evaluated with electron microscopy. Results Degeneration findings in muscle after botulinum toxin injection revealed no significant difference between freshly reconstituted and stored toxin in the early period（the fifth day）.When stored （for 2 weeks） toxin was used， atrophic changes in the muscle were the same as the fresh toxin at 12 weeks.On nerve evaluation， the changes on nerve ultrastructure shows similar degeneration as the muscle. Conclusion Injecting Botulinum toxin type A into local muscle and evaluated with electron microscopy is a reasonable way to evaluate alterations in destination muscle and nerve ultrastructure.It seems that stored BTXA for 2 weeks and freshly reconstituted BTXA has the same initial potency，and it provides a new study and treatment for clinical research.

Key words：botulinum toxin A； ultrastructure； degeneration； electron microscopy

A型肉毒毒素（Botulinum Toxin A，BTXA）作為一種神經毒素，可選擇性地作用于周圍運動神經末梢，抑制乙酰膽堿的釋放、融合和?？浚a生化學去神經作用，導致肌肉松弛麻痹[1-2]。A 型肉毒毒素用于面部美容除皺始于20世紀90年代初。由于獨特的除皺功效，目前注射用A型肉毒毒素（BTXA） 在國內已成為較為廣泛應用的面部美容生物制品，應用越來越廣泛[3]。A 型肉毒毒素制造商建議：根據(jù)制品特性，應將A 型肉毒毒素儲存于 -20℃～-5℃冰箱，生理鹽水配置后宜在4h內使用，否則會影響其效價[4-7]。由于小劑量A 型肉毒毒素即可產生巨大效應，如此會有相當一部分A 型肉毒毒素剩余，造成制劑的浪費，處理不當更會污染環(huán)境。國外已有研究機構對新鮮和儲存A 型肉毒毒素效價進行了對照研究，但針對肌注肉毒毒素神經、肌肉組織超微結構變化的研究鮮有報道。因此，本實驗針對這方面在動物身上進行實驗，研究新鮮和儲存A 型肉毒毒素對運動神經和神經支配肌肉的超微結構的影響，以期為今后臨床應用提供可靠依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料：實驗動物：新西蘭白兔32只，普通型，健康，雄性，體重1.5～2kg，由上海第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。實驗試劑：A型肉毒毒素由蘭州生物制品研究所研制，商品名為“衡力”，凍干結晶肉毒毒素，規(guī)格為100U/瓶，該制劑臨床應用廣泛，安全性及有效性較高[8]；75%乙醇等化學試劑均購自上海長海醫(yī)院。實驗器材：LKB-Ⅱ超薄切片機，瑞士制造；日立 H800 透射電子顯微鏡，日本制造。

1.2動物模型制備和分組：新西蘭白兔32只，實驗前兩周購入，單籠喂養(yǎng)，混合飲食，動物飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境下進食消毒顆粒飼料，飲消毒水，室溫（23±0）℃，濕度56%，12h/12h間隔照明，定期紫外線消毒與排風。實驗過程中對動物處置符合2006年科學技術部發(fā)布的關于善待實驗動物的指導性意見[9]。平均體重為1.80kg。術前常規(guī)禁食。本實驗動物被隨機分成A組（16只）和B組（16只），各組動物均取右耳注射A型肉毒毒素，左側耳前肌注射等量生理鹽水作為對照。每安瓿A型肉毒毒素含 100U，使用前用生理鹽水 2ml 稀釋配置成50U/ml。配好制劑即刻注射，剩余儲存于 4℃冷藏箱內，儲存時間為2周。選擇新西蘭白兔右耳耳前肌為注射部位，耳前肌的起始處附著于同側額骨，距離內眥約 2cm，止于同側耳腹內側肌緣（距耳基底3cm左右），其最小安全劑量為2.5U[10]。A組局部注射新鮮配置好的A型肉毒毒素0.05ml（2.5U）， B組注射配置后儲存2周的A型肉毒毒素0.05ml（2.5U）。A、B組各隨機分為2組，每組8只，分別于注射后第5天和第12周進行其肌肉組織活檢，對照側同時間點取活檢。行肌肉、神經組織電鏡觀察。

1.3組織活檢：每組左側耳前肌作為自身對照組（G0），A組隨機分為2組，每組8只（設為G1、G2），分別于注射后第5天和第12周進行其肌肉組織活檢，B組隨機分為2組，每組8只（設為G3 、G4），分別于注射后第5天和第12周進行其肌肉組織活檢，對照組同時間點取活檢。耳前肌活檢采用縱行切口，鈍性分離，垂直切斷取出。取下的耳前肌及神經均置于4%多聚甲醛固定4h以上；后將組織用磷酸緩沖液（PBS）0.1mol/L漂洗；鋨酸1%固定2h后用PBS漂洗；梯度（30%、50%、70%、90%及100%）丙酮脫水；用環(huán)氧樹脂包埋、聚合等；LKB-Ⅱ超薄切片機切片，最后行日立H800透射電子顯微鏡觀察。

1.4神經、肌肉組織學觀察：分別觀察實驗組和對照組的神經、肌肉標本。主要觀察指標：肌肉萎縮指標包括A-I帶溶解/消失、Z線溶解/消失、細胞核遷移、肌原纖維溶解和肌纖維變性等[13]。神經的華勒（氏）變性指標包括髓鞘松散/溶解、Schwann細胞漿變性、軸索松散/溶解、無髓神經松散/溶解和基質變性等。上述樣本采用半定量評分系統(tǒng)[11]評估變性的數(shù)量和程度。未觀察到任何變性計0分；觀察到明顯的變性計5分。

1.4統(tǒng)計學處理：對電鏡觀察結果采用χ2檢驗（ Kruskal-Wallis Test）進行統(tǒng)計學處理，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1肌肉組織學觀察結果：①每組左側耳前肌作為自身對照，對照組（G0）耳前肌肌肉結構正常，無變性表現(xiàn)（P>0.05）；②A組新鮮的肉毒毒素注射早期組（G1）與對照組比較表現(xiàn)為明顯的肌肉變性（P<0.001）；③A組新鮮肉毒毒素注射晚期組（G2）與對照組比較表現(xiàn)為明顯的肌肉變性（P<0.001）；④B組儲存2周的肉毒毒素注射早期組（G3）與對照組比較表現(xiàn)為明顯的肌肉變性（P=0.001）；⑤B組儲存2周的肉毒毒素注射晚期組（G4）與對照組比較表現(xiàn)為明顯的肌肉變性（P=0.003）；⑥A組新鮮的肉毒毒素注射早期組（G1）同B組儲存2周的肉毒毒素注射早期組（G3）比較，二者肌肉變性程度無顯著差別（P=0.142）；⑦A組新鮮肉毒毒素注射晚期組（G2）和B組儲存2周的肉毒毒素注射晚期組（G4）比較，電鏡觀察的超微結構變化結果同上（P=0.621）。肌肉變性標準評分見表1。

2.2神經組織學觀察結果：①每組左側耳前肌作為自身對照，對照側的耳前肌神經結構正常，無變性表現(xiàn)（P>0.05）；②A組新鮮的肉毒毒素注射早期組（G1）與對照組比較表現(xiàn)為明顯的神經變性（P<0.001）；③A組新鮮肉毒毒素注射晚期組（G2）與對照組比較表現(xiàn)為明顯的神經變性（P=0.003）④B組儲存2周的肉毒毒素注射早期組（G3）與對照組比較表現(xiàn)為明顯的神經變性（P=0.001）；⑤B組儲存2周的肉毒毒素注射晚期組（G4）與對照組比較表現(xiàn)為明顯的神經變性（P=0.003）；⑥A組新鮮的肉毒毒素注射早期組（G1）同B組儲存2周的肉毒毒素注射早期組（G3）比較，二者神經變性程度無顯著差別（P=0.070）；⑦A組新鮮肉毒毒素注射晚期組（G2）和B組儲存2周的肉毒毒素注射晚期組（G4）比較，電鏡觀察的超微結構變化結果同上（P=0.477）。神經變性標準評分見表2。

3 討論

肉毒毒素制造商建議：配置后A型肉毒毒素（BTXA）使用時間宜控制在4h內，原因是神經毒素的活性會隨時間延長而下降。這項用藥指南讓很多注射醫(yī)生面臨兩難抉擇：一方面由于小劑量的BTXA即可產生巨大效應，如此會有相當一部分 BTXA 剩余，造成制劑的浪費，處理不當更會污染環(huán)境；另一方面，因為4h內使用這一狹窄的時間范圍，醫(yī)生需要花費很多心思來安排足夠多的患者在這個時限內完成注射，但往往事與愿違。所以國內、外已有不少臨床醫(yī)生采取將未用完的A型肉毒毒素存儲起來以備后續(xù)使用。本實驗對儲存BTXA的相關效價展開對比研究，以期指導肉毒毒素在臨床上的應用。

國外已有關于肉毒毒素臨床應用觀察的實驗研究，證實了儲存一定時間的BTXA，其生物學活性未受明顯影響。Garcia 和 Fulton[12]研究將新鮮配好的 BTXA與儲存時間依次為 1、2和4周的BTXA 對比，通過物理檢查等方法主觀評價BTXA 治療的患者，得出了新鮮與儲存BTXA在效價上無明顯差別的結論。1997 年，Sloop等[13]也做過類似實驗，實驗對象為 8例患者的指 （趾） 短伸肌，行肌電圖描記結果，得出新鮮與儲存 2周的BTXA 的效價無顯著性差異的結論。Jabor等[14]用新西蘭白兔模型來比較新鮮和儲存BTXA的效價。此項實驗將新鮮BTXA與分別儲存了 2、6、12 周的 BTXA 比較，采用電生理學等實驗方法，得出新鮮和儲存的BTXA原始效價相同的結論。近年來，Thomas and Siupsinskiene[15]進行了肉毒毒素治療43例喉肌痙攣患者的實驗研究，他們得出結論：平均儲存時間約為2.4周的肉毒毒素，其效價同新鮮肉毒毒素相比無顯著性差異。

本實驗動物被隨機分成A組（16只）和B組（16只），各組動物均取右耳注射，左側耳前肌注射等量生理鹽水作為對照。并通過超微電鏡觀察實驗得出：儲存2周的BTXA與新鮮BTXA比較，二者對神經、肌肉變性的影響基本相同。

那么，配置好的A型肉毒毒素必須要在4h才時間窗口期內使用嗎？本實驗證實：儲存的BTXA與新鮮的BTXA比較，二者均能導致肌肉、神經變性，且變性情況無明顯差別。這一實驗得出結論：儲存一定時間的A型肉毒毒素，其效價未受影響，且無副反應發(fā)生。關于肉毒毒素的臨床實驗國外已有研究。國內臨床實驗鮮有開展，且關于肉毒毒素儲存后藥品成分變化，應進行生化實驗等進一步研究。

[參考文獻]

[1]Morbiato L，Carli L，Johnson EA，et al. Neuromuscular paralysis and recovery in mice injected with botulinum neurotoxins A and C[J].Eur J Neurosci，2007，25（9）：2697-2704.

[2]Madsen JE，Hukkanen M，Aune AK，et al. Fracture healing and callus innervation after peripheral nerve resection in rats[J].Clin Orthop Relat Res，1998，351：230-240.

[3]李青峰.A型肉毒毒素在美容醫(yī)學中的應用進展及其安全性探討[J].中國美容醫(yī)學，2005，14（3）：264-266.

[4]Nthony VB.The cosmetic use of Botulinum toxin type A [J].Inter J Dermatol，1999，38：641-655.

[5]Matarasso A，Anand K，Chia C，et al.The plastic surgery educational foundation DATA committee，Borulinum toxin[J].Plast Reconstr Surg，2002，109：1191.

[6]Rohrich RJ，JanisJE，F(xiàn)agienS，et al.The cosmetic use of botulinum toxin[J].Plast Reconstr Surg，2003，112 （5）：177S-187S.

[7]Cather JC，Cather JC，Menter A，et al. Update on botulinum toxin A for ficial sthetics[J].Dermatol Clin，2002，20：749-761.

[8]陳平紆，吳強，謝貴林，等.衡力改善眉間紋的安全性和有效性[J].中國美容醫(yī)學，2012，21（11）：1895-1900.

[9]The Ministry of Science and Technology of the Peoples Republic of China.Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.中華人民共和國科學技術部. 關于善待實驗動物的指導性意見.2006-09-30.

[10]Jabor MA，Kaushik R，Shayani P，et al.Efficacy of reconstituted and stored botulinum toxin type A：an electrophysiologic and visual study in the auricular muscle of the rabbit [J].Plast Reconstr Surg，2003，111：2419-2431.

[11]KilicA，Dingil O，Erkula G，et al. Evaluation of the muscles around the knee in rabbits whose anterior cruciate and/or medial collateral ligaments were dissected [J].Arch Orthop Trauma Surg，2004，124：626-630.

[12]Garcia A，F(xiàn)ulton JE.Cosmetic denervation of the muscles of facial expression with botulinumtoxin[J].Dermatol Surg，1996，22：39-43.

[13]Sloop RR，Cole BA，Escutin RO. Reconstituted botulinum toxin type A does not lose potency in humans if it is refrozen or refrigerated for 2 weeks before use[J].Neurology，1997，48（1）：249-253.

[14]Jabor MA，Kaushik R，Shayani P，et al. Efficacy of reconstituted and stored botulinum toxin type A： an electrophysiologic and visual study in the auricular muscle of the rabbit[J].Plast Reconstr Surg，2003，111（7）：2419-2426.

[15]Thomas JP，Siupsinskiene N.Frozen versus fresh reconstituted Botox for laryngeal dystonia[J].Otolaryngol Head Neck Surg， 2006，135（2）：204-208.

[收稿日期]2014-07-20 [修回日期]2014-08-20

編輯/何志斌