安彩霞等

目的：探討氨甲環(huán)酸對(duì)中波紫外線照射后黑素細(xì)胞增殖及酪氨酸酶代謝的影響。方法：設(shè)立紫外線照射組和非照射組，以不同濃度的氨甲環(huán)酸作用于黑素細(xì)胞，cck-8法測(cè)定黑素細(xì)胞增殖；多巴氧化方法測(cè)定酪氨酸酶活性，RT-PCR方法測(cè)定酪氨酸酶mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：氨甲環(huán)酸對(duì)兩組黑素細(xì)胞的增殖均無(wú)明顯抑制作用（P>0.05）；而對(duì)酪氨酸酶活性和酪氨酸酶的mRNA表達(dá)有抑制作用（P<0.05），兩組結(jié)果比較無(wú)明顯差異；結(jié)論：氨甲環(huán)酸對(duì)黑素細(xì)胞的酪氨酸酶的抑制作用與中波紫外線照射無(wú)直接關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]氨甲環(huán)酸；黑素細(xì)胞；紫外線；影響

[中圖分類號(hào)]R62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2014）20-1708-03

Study on the impact of tranexamic acid in cultured human melanocytes after ultraviolet irradiation

AN Cai-xia1，2，ZHAO Ya-nan2，WANG Hong-juan2， PU Xiong-ming2

（1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830001，Xinjiang，China；2.The Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830001，Xinjiang，China）

Abstract： Objective To study the impact of tranexamic acid on cell proliferation and tyrosinase activity in cultured human melanocytes after ultraviolet irradiation. Methods To set up the ultraviolet irradiation and irradiation group， melanocytes was incubated different concentrations of tranexamic acid.Cell proliferation was measured with cck-8 assay；The tyrosinase activity was detected by DOPA-oxidation；Tyrosinase mRNA level was detected by RT-PCR method. Results Melanocytes proliferation was not significantly inhibitted by tranexamic acid compared with the untreated control（P>0.05）；but tyrosinase activity and tyrosinase mRNA level was restrained respectively（P<0.05）.The conclution was similary. Conclusion The tyrosinase activity was directly inhibitted by tranexamic acid，thereby melanogenesis was reduced，This result is not affected by ultraviolet irradiation.

Key words：tranexamic acid；melanocytes； ultraviolet；effect

氨甲環(huán)酸（Tranexamic acid，TA）是臨床常用的抗纖溶止血藥物。近年來，經(jīng)臨床研究報(bào)道治療黃褐斑安全有效，而且能減少紫外線或激光治療后的反應(yīng)性色素沉著。對(duì)其具體治療機(jī)制尚在探討之中，我們此次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比觀察氨甲環(huán)酸對(duì)于中波紫外線照射和非照射的黑素細(xì)胞影響方面有何差異，以進(jìn)一步探討藥物發(fā)揮作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑：氨甲環(huán)酸粉劑：中國(guó)食品藥品檢定研究院；胎牛血清，胰蛋白酶（Trypsin，Gibco公司，美國(guó)）；黑素細(xì)胞培養(yǎng)基（M2），CCK-8試劑，TritonX-100，左旋多巴（L-D0PA，Sigma公司，美國(guó)）；窄頻中波紫外線燈管：飛利浦9w；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）；凝膠成相系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)）；PCR儀為MJReseareh公司；TIAN script CDNA：天根生物制品公司；PCR試劑盒：購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。引物由上海生工生物有限公司合成。

TYR基因引物序列為：

F 5-TTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCT-3

R 5-TCATCTCCTGTCAGCTTCTGGA-3bp：705bp

GAPDH基因引物序列為：

F 5- TCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3

R 5-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3bp：363bp

1.2研究方法

1.2.1 正常人黑素細(xì)胞的培養(yǎng)：取正常人包皮皮膚，剪成碎塊后以0.25%胰酶冷消化12～15h，胎牛血清終止消化后離心并收集細(xì)胞，M1培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代。每2～3天換一次液，待出現(xiàn)大量典型梭形黑素細(xì)胞后（約10天），再行胰酶消化，離心收集黑素細(xì)胞，置于M2培養(yǎng)基中，換瓶培養(yǎng)（T1代）。培養(yǎng)至3～4代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑素細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 黑素細(xì)胞增殖的測(cè)定：將傳代細(xì)胞的濃度調(diào)整至5×104個(gè)/孔后加入96孔培養(yǎng)板。24h細(xì)胞貼壁后設(shè)中波紫外線照射組（40mJ/cm2）和非紫外線照射組，用含不同濃度氨甲環(huán)酸的新鮮培養(yǎng)液換液1次，并設(shè)立藥物陰性對(duì)照組，每一處理因素設(shè)立4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。于結(jié)束前4h，加入cck-8液50μl/孔，置酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)吸收光光度值。

1.2.3 酪氨酸酶活性的測(cè)定：96孔培養(yǎng)板加入細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/孔的黑素細(xì)胞懸液，24h細(xì)胞貼壁后設(shè)中波紫外線照射組（40mJ/cm2）和非紫外線照射組，再用含不同濃度氨甲環(huán)酸的新鮮培養(yǎng)液換液1次，并設(shè)立藥物陰性對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48h。48h后棄去上清液，PBS洗2次，每孔加0.1%的TritonX-100溶液100μl，振蕩15min，使細(xì)胞完全破裂，加入0.1%L-DOPA溶液50μl/孔，37℃反應(yīng)過夜，于酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處行吸收光光度值測(cè)定。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）方法測(cè)定酪氨酸酶的mRNA表達(dá)首先收集培養(yǎng)皿里的細(xì)胞（經(jīng)紫外線和氨甲環(huán)酸藥物的處理，處理方法同前）再行RNA的提取，電泳察看RNA的濃度和完整性；按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，cDNA進(jìn)行定量后置于-70℃保存，進(jìn)行后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)。PCR擴(kuò)增條件按以下設(shè)置：Tyr：預(yù)變性94℃5min 94℃60s-55℃60s-72℃60s，30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。GAPDH預(yù)變性94℃5min94℃60s-56℃60s-72℃60s，30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。PCR結(jié)果分析采用凝膠成像儀和Quantity one l-D軟件采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所測(cè)數(shù)據(jù)均以表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)前經(jīng)多巴染色陽(yáng)性證實(shí)為黑素細(xì)胞（如圖1）。

2.2 不同濃度的氨甲環(huán)酸對(duì)中波紫外線照射組和非紫外線照射組的黑素細(xì)胞增殖的影響：0.05～1mg/ml濃度范圍內(nèi)的氨甲環(huán)酸對(duì)兩組體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞增殖均無(wú)明顯抑制作用（P>0.05），見表1。

2.3 不同濃度氨甲環(huán)酸對(duì)中波紫外線照射組和非紫外線照射組的體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響：與藥物陰性對(duì)照組比較，0.5mg/ml和1mg/ml濃度的氨甲環(huán)酸對(duì)兩組黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性均具有明顯抑制作用（P<0.05），見表2。

2.4氨甲環(huán)酸對(duì)酪氨酸酶mRNA表達(dá)的影響：給以0.05～1mg/ml濃度的氨甲環(huán)酸處理后，中波紫外線照射組和非紫外線照射組的黑素細(xì)胞的酪氨酸酶的mRNA表達(dá)均有下調(diào)，可見氨甲環(huán)酸對(duì)于酪氨酸酶的mRNA有抑制作用，且抑制作用隨著濃度增加而增大（如圖2）。

3 討論

氨甲環(huán)酸是一種臨床常用的抗纖溶止血藥物[1-2]。近年來，國(guó)內(nèi)外大量臨床研究報(bào)道，氨甲環(huán)酸治療黃褐斑安全有效，無(wú)明顯并發(fā)癥[3-6]。黃褐斑是一種由于黑素細(xì)胞合成黑素的功能增加引起的損容性皮膚病，而且紫外線照射已證實(shí)是黃褐斑形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7]。既往實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，氨甲環(huán)酸化學(xué)結(jié)構(gòu)與酪氨酸部分相似，可通過和酪氨酸競(jìng)爭(zhēng)，抑制酪氨酸酶活性最終抑制了黑色素合成[8]。Maeda K等[9]的體外實(shí)驗(yàn)提示，氨甲環(huán)酸對(duì)黑素合成產(chǎn)生的抑制作用是通過角質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的，通過抑制角質(zhì)細(xì)胞分泌的單鏈尿激酶型纖維蛋白溶解酶原激活劑（sc-UPA）的作用，減少黑素顆粒從黑素細(xì)胞向角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)而產(chǎn)生的。他們進(jìn)行動(dòng)物研究還發(fā)現(xiàn)氨甲環(huán)酸可以減輕紫外線照射后引起的色素沉著，并減少皮損處的紅斑反應(yīng)[10]。Na JI[11]對(duì)比觀察氨甲環(huán)酸局部注射治療后黃褐斑的皮損組織內(nèi)黑素細(xì)胞的數(shù)量并無(wú)明顯變化，而黑素含量較治療前有所減少。J.I. Na等[12]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，氨甲環(huán)酸對(duì)于黃褐斑皮損有治療作用，而對(duì)正常皮膚則無(wú)作用。氨甲環(huán)酸究竟是如何發(fā)揮治療黃褐斑作用的，其作用機(jī)制和紫外線照射有無(wú)關(guān)聯(lián)，尚需我們進(jìn)一步探討。為了更加全面的了解氨甲環(huán)酸對(duì)于黑素細(xì)胞的影響研究，本研究設(shè)置了中波紫外線照射和非照射組，觀察氨甲環(huán)酸對(duì)于體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞的增殖和對(duì)酪氨酸酶的影響在兩組間有無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量的氨甲環(huán)酸對(duì)于兩組黑素細(xì)胞的增殖均未見明顯抑制作用（P>0.05），提示氨甲環(huán)酸在治療黃褐斑的過程中，并不是減少了色素沉著部位的黑素細(xì)胞數(shù)量發(fā)揮作用，這與先前有研究顯示在氨甲環(huán)酸注射的皮損內(nèi)，黑素細(xì)胞的數(shù)量無(wú)明顯變化的結(jié)論相符。而氨甲環(huán)酸對(duì)于兩組的黑素細(xì)胞酪氨酸酶和酪氨酸酶的基因表達(dá)均有抑制作用，這說明氨甲環(huán)酸對(duì)于酪氨酸酶的抑制作用不僅僅是與酪氨酸結(jié)構(gòu)相似產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制的結(jié)果，而且這種作用與中波紫外線照射似乎并無(wú)直接關(guān)系，提示氨甲環(huán)酸對(duì)紫外線照射后的炎性色素沉著的治療作用或有其他條件的參與。

綜上所述，氨甲環(huán)酸不僅可直接作用于黑素細(xì)胞，降低酪氨酸酶的含量，而且對(duì)于酪氨酸酶的基因表達(dá)亦有抑制作用，由此發(fā)揮減淡色斑的作用，而這種作用與中波紫外線的直接照射并無(wú)明顯關(guān)系，其對(duì)于黃褐斑的作用機(jī)制和抑制紫外線照射后的色素沉著的原因尚需進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2014-08-12 [修回日期]2014-09-15

編輯/何志斌