安彩霞等

目的：探討氨甲環(huán)酸對中波紫外線照射后黑素細胞增殖及酪氨酸酶代謝的影響。方法：設立紫外線照射組和非照射組，以不同濃度的氨甲環(huán)酸作用于黑素細胞，cck-8法測定黑素細胞增殖；多巴氧化方法測定酪氨酸酶活性，RT-PCR方法測定酪氨酸酶mRNA表達水平。結果：氨甲環(huán)酸對兩組黑素細胞的增殖均無明顯抑制作用（P>0.05）；而對酪氨酸酶活性和酪氨酸酶的mRNA表達有抑制作用（P<0.05），兩組結果比較無明顯差異；結論：氨甲環(huán)酸對黑素細胞的酪氨酸酶的抑制作用與中波紫外線照射無直接關系。

[關鍵詞]氨甲環(huán)酸；黑素細胞；紫外線；影響

[中圖分類號]R62 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）20-1708-03

Study on the impact of tranexamic acid in cultured human melanocytes after ultraviolet irradiation

AN Cai-xia1，2，ZHAO Ya-nan2，WANG Hong-juan2， PU Xiong-ming2

（1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830001，Xinjiang，China；2.The Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830001，Xinjiang，China）

Abstract： Objective To study the impact of tranexamic acid on cell proliferation and tyrosinase activity in cultured human melanocytes after ultraviolet irradiation. Methods To set up the ultraviolet irradiation and irradiation group， melanocytes was incubated different concentrations of tranexamic acid.Cell proliferation was measured with cck-8 assay；The tyrosinase activity was detected by DOPA-oxidation；Tyrosinase mRNA level was detected by RT-PCR method. Results Melanocytes proliferation was not significantly inhibitted by tranexamic acid compared with the untreated control（P>0.05）；but tyrosinase activity and tyrosinase mRNA level was restrained respectively（P<0.05）.The conclution was similary. Conclusion The tyrosinase activity was directly inhibitted by tranexamic acid，thereby melanogenesis was reduced，This result is not affected by ultraviolet irradiation.

Key words：tranexamic acid；melanocytes； ultraviolet；effect

氨甲環(huán)酸（Tranexamic acid，TA）是臨床常用的抗纖溶止血藥物。近年來，經(jīng)臨床研究報道治療黃褐斑安全有效，而且能減少紫外線或激光治療后的反應性色素沉著。對其具體治療機制尚在探討之中，我們此次進行實驗對比觀察氨甲環(huán)酸對于中波紫外線照射和非照射的黑素細胞影響方面有何差異，以進一步探討藥物發(fā)揮作用的機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑：氨甲環(huán)酸粉劑：中國食品藥品檢定研究院；胎牛血清，胰蛋白酶（Trypsin，Gibco公司，美國）；黑素細胞培養(yǎng)基（M2），CCK-8試劑，TritonX-100，左旋多巴（L-D0PA，Sigma公司，美國）；窄頻中波紫外線燈管：飛利浦9w；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司），全自動酶標儀（Bio-Rad公司，美國）；凝膠成相系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）；PCR儀為MJReseareh公司；TIAN script CDNA：天根生物制品公司；PCR試劑盒：購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。引物由上海生工生物有限公司合成。

TYR基因引物序列為：

F 5-TTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCT-3

R 5-TCATCTCCTGTCAGCTTCTGGA-3bp：705bp

GAPDH基因引物序列為：

F 5- TCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3

R 5-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3bp：363bp

1.2研究方法

1.2.1 正常人黑素細胞的培養(yǎng)：取正常人包皮皮膚，剪成碎塊后以0.25%胰酶冷消化12～15h，胎牛血清終止消化后離心并收集細胞，M1培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代。每2～3天換一次液，待出現(xiàn)大量典型梭形黑素細胞后（約10天），再行胰酶消化，離心收集黑素細胞，置于M2培養(yǎng)基中，換瓶培養(yǎng)（T1代）。培養(yǎng)至3～4代，選擇對數(shù)生長期的黑素細胞進行實驗。

1.2.2 黑素細胞增殖的測定：將傳代細胞的濃度調(diào)整至5×104個/孔后加入96孔培養(yǎng)板。24h細胞貼壁后設中波紫外線照射組（40mJ/cm2）和非紫外線照射組，用含不同濃度氨甲環(huán)酸的新鮮培養(yǎng)液換液1次，并設立藥物陰性對照組，每一處理因素設立4個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。于結束前4h，加入cck-8液50μl/孔，置酶標儀450nm波長測吸收光光度值。

1.2.3 酪氨酸酶活性的測定：96孔培養(yǎng)板加入細胞濃度為5×104個/孔的黑素細胞懸液，24h細胞貼壁后設中波紫外線照射組（40mJ/cm2）和非紫外線照射組，再用含不同濃度氨甲環(huán)酸的新鮮培養(yǎng)液換液1次，并設立藥物陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48h。48h后棄去上清液，PBS洗2次，每孔加0.1%的TritonX-100溶液100μl，振蕩15min，使細胞完全破裂，加入0.1%L-DOPA溶液50μl/孔，37℃反應過夜，于酶標儀450nm波長處行吸收光光度值測定。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）方法測定酪氨酸酶的mRNA表達首先收集培養(yǎng)皿里的細胞（經(jīng)紫外線和氨甲環(huán)酸藥物的處理，處理方法同前）再行RNA的提取，電泳察看RNA的濃度和完整性；按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進行RNA的反轉(zhuǎn)錄，cDNA進行定量后置于-70℃保存，進行后續(xù)PCR實驗。PCR擴增條件按以下設置：Tyr：預變性94℃5min 94℃60s-55℃60s-72℃60s，30個循環(huán)，末次循環(huán)結束后72℃延伸10min。GAPDH預變性94℃5min94℃60s-56℃60s-72℃60s，30個循環(huán)，末次循環(huán)結束后72℃延伸10min。PCR結果分析采用凝膠成像儀和Quantity one l-D軟件采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學方法：所測數(shù)據(jù)均以表示，應用SPSS17.0軟件分析，對實驗結果進行單因素方差分析，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1實驗前經(jīng)多巴染色陽性證實為黑素細胞（如圖1）。

2.2 不同濃度的氨甲環(huán)酸對中波紫外線照射組和非紫外線照射組的黑素細胞增殖的影響：0.05～1mg/ml濃度范圍內(nèi)的氨甲環(huán)酸對兩組體外培養(yǎng)的黑素細胞增殖均無明顯抑制作用（P>0.05），見表1。

2.3 不同濃度氨甲環(huán)酸對中波紫外線照射組和非紫外線照射組的體外培養(yǎng)黑素細胞酪氨酸酶活性的影響：與藥物陰性對照組比較，0.5mg/ml和1mg/ml濃度的氨甲環(huán)酸對兩組黑素細胞的酪氨酸酶活性均具有明顯抑制作用（P<0.05），見表2。

2.4氨甲環(huán)酸對酪氨酸酶mRNA表達的影響：給以0.05～1mg/ml濃度的氨甲環(huán)酸處理后，中波紫外線照射組和非紫外線照射組的黑素細胞的酪氨酸酶的mRNA表達均有下調(diào)，可見氨甲環(huán)酸對于酪氨酸酶的mRNA有抑制作用，且抑制作用隨著濃度增加而增大（如圖2）。

3 討論

氨甲環(huán)酸是一種臨床常用的抗纖溶止血藥物[1-2]。近年來，國內(nèi)外大量臨床研究報道，氨甲環(huán)酸治療黃褐斑安全有效，無明顯并發(fā)癥[3-6]。黃褐斑是一種由于黑素細胞合成黑素的功能增加引起的損容性皮膚病，而且紫外線照射已證實是黃褐斑形成的獨立危險因素[7]。既往實驗研究認為，氨甲環(huán)酸化學結構與酪氨酸部分相似，可通過和酪氨酸競爭，抑制酪氨酸酶活性最終抑制了黑色素合成[8]。Maeda K等[9]的體外實驗提示，氨甲環(huán)酸對黑素合成產(chǎn)生的抑制作用是通過角質(zhì)細胞介導的，通過抑制角質(zhì)細胞分泌的單鏈尿激酶型纖維蛋白溶解酶原激活劑（sc-UPA）的作用，減少黑素顆粒從黑素細胞向角質(zhì)細胞轉(zhuǎn)運而產(chǎn)生的。他們進行動物研究還發(fā)現(xiàn)氨甲環(huán)酸可以減輕紫外線照射后引起的色素沉著，并減少皮損處的紅斑反應[10]。Na JI[11]對比觀察氨甲環(huán)酸局部注射治療后黃褐斑的皮損組織內(nèi)黑素細胞的數(shù)量并無明顯變化，而黑素含量較治療前有所減少。J.I. Na等[12]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，氨甲環(huán)酸對于黃褐斑皮損有治療作用，而對正常皮膚則無作用。氨甲環(huán)酸究竟是如何發(fā)揮治療黃褐斑作用的，其作用機制和紫外線照射有無關聯(lián)，尚需我們進一步探討。為了更加全面的了解氨甲環(huán)酸對于黑素細胞的影響研究，本研究設置了中波紫外線照射和非照射組，觀察氨甲環(huán)酸對于體外培養(yǎng)的黑素細胞的增殖和對酪氨酸酶的影響在兩組間有無差異。實驗結果表明，不同劑量的氨甲環(huán)酸對于兩組黑素細胞的增殖均未見明顯抑制作用（P>0.05），提示氨甲環(huán)酸在治療黃褐斑的過程中，并不是減少了色素沉著部位的黑素細胞數(shù)量發(fā)揮作用，這與先前有研究顯示在氨甲環(huán)酸注射的皮損內(nèi)，黑素細胞的數(shù)量無明顯變化的結論相符。而氨甲環(huán)酸對于兩組的黑素細胞酪氨酸酶和酪氨酸酶的基因表達均有抑制作用，這說明氨甲環(huán)酸對于酪氨酸酶的抑制作用不僅僅是與酪氨酸結構相似產(chǎn)生競爭性抑制的結果，而且這種作用與中波紫外線照射似乎并無直接關系，提示氨甲環(huán)酸對紫外線照射后的炎性色素沉著的治療作用或有其他條件的參與。

綜上所述，氨甲環(huán)酸不僅可直接作用于黑素細胞，降低酪氨酸酶的含量，而且對于酪氨酸酶的基因表達亦有抑制作用，由此發(fā)揮減淡色斑的作用，而這種作用與中波紫外線的直接照射并無明顯關系，其對于黃褐斑的作用機制和抑制紫外線照射后的色素沉著的原因尚需進一步研究。

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[收稿日期]2014-08-12 [修回日期]2014-09-15

編輯/何志斌