宋小雙 鄧勛 遇文婧 尹大川 宋瑞清

摘要 [目的]為評(píng)價(jià)內(nèi)生真菌D202的生防價(jià)值以及生理學(xué)特性。[方法]通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定生防內(nèi)生真菌D202對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的抑制作用，并且對(duì)其生理學(xué)學(xué)特性進(jìn)行了研究。[結(jié)果]拮抗試驗(yàn)中D202對(duì)絲核菌的抑制率為67.25%，相對(duì)抑制效果為3.54，其非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)絲核菌的抑制率為72.35%，菌株D202及其代謝產(chǎn)物可有效抑制立枯絲核菌的生長(zhǎng)；內(nèi)生菌株D202生長(zhǎng)最適碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，在溫度為25℃、培養(yǎng)基pH為7時(shí)菌落生長(zhǎng)最好。[結(jié)論]篩選得到的生防內(nèi)生菌D202具有開(kāi)發(fā)生物源殺菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞 深色有隔內(nèi)生真菌；生防內(nèi)生菌；立枯絲核菌；抑制作用；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）27-09274-02

Inhibiting Effect of Dark Septate Endophyte Fungi D202 on Rhizoctonia solani and Its Physiological Characteristics

SONG Xiaoshuang¹， DENG Xun²， YU Wenjing¹， SONG Ruiqing2* et al

（1.Heilongjiang Forestry Protect Institute， Harbin， Heilongjiang 150040； 2.Northeast Forestry University， Harbin Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective]The research aimed to evaluate the biocontrol ability and physiological characterisitics of endophyte strain D202. [Method]Dark septate endophyte fungi D202 was evaluated against R. solani in confront culture and through production of nonvolatile inhibitors， and the physiological characteristics of D202 were researched by growth rate method. [Result] In the dual culture， D202 could inhibit the growth of R.solani effectively， the inhibition rate was 67.25%， and relative inhibit rate was 3.54. The nonvolatile antibiotics inhibited the growth of R.solani effectively， and the inhibit rate was 72.35%. Strain D202 could grow well in PDA media whose pH was 7.0. The optimum carbon sources for D202 growing were glucose， and the optimum nitrogen sources were peptone， and the optimum temperature for growing was 25 ℃.[Conclusion]Endophyte D202 had the potential to develop biocontrol agents.

Key words Dark septate endophyte fungi； Biological controls endophytes； Rhizoctonia solani； Inhibiting effect； Physiological characteristics

隨著化學(xué)藥劑的過(guò)度使用，土壤微生態(tài)環(huán)境被破壞，苗木長(zhǎng)勢(shì)不良以及有害生物的抗藥性等問(wèn)題日益突出，環(huán)境和諧性病蟲(chóng)害防控技術(shù)日益受到重視。同時(shí)，農(nóng)副產(chǎn)品的綠色健康已成為關(guān)注的焦點(diǎn)，因此現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)的發(fā)展要求減少化學(xué)藥劑的使用，發(fā)展以生物防治為核心內(nèi)容的生態(tài)控制技術(shù)。在當(dāng)前提倡的土壤保健和植物保健技術(shù)等土壤生物修復(fù)和生態(tài)調(diào)控理念中，通過(guò)引入植物根際有益微生物和生防菌株，可以改善土壤環(huán)境，促進(jìn)苗木生長(zhǎng)，提高植物抗逆性^[1]。因此，篩選高效菌株，開(kāi)發(fā)生物源的生防菌劑日益受到人們的關(guān)注。

深色有隔內(nèi)生真菌（DSE）是植物根部的內(nèi)生菌。在高寒、干旱、污染土壤以及鹽堿環(huán)境等極端和逆境環(huán)境下，它均可與宿主植物形成互惠的共生關(guān)系^[2]，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、改善礦物質(zhì)吸收、病害生物防治、提高植物抗逆性等方面作用顯著^[3-4]。在病害防治方面，DSE真菌可以在宿主根系定殖，并且有效抑制土傳病害的發(fā)生，在防治白菜根腫病^[5-6]和番茄枯萎病上^[7]均取得實(shí)際的控制效果。此外，通過(guò)誘導(dǎo)植物抗性，對(duì)葉部病害也有一定的預(yù)防作用。深色有隔內(nèi)生真菌D202是從針葉樹(shù)根部分離得到的內(nèi)生真菌。通過(guò)形態(tài)鑒定和ITS測(cè)序，它屬于Phialocephala fortinii s.l.Acephala applanata species complex （PAC），為典型的植物根部深色有隔內(nèi)生真菌。在前期篩選中，它對(duì)立枯絲核菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，具有開(kāi)發(fā)生防菌的潛力。筆者通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)和發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)，測(cè)定了D202菌株對(duì)立枯絲核菌的抑制作用，并且對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究其抑菌機(jī)理和田間應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試深色有隔內(nèi)生真菌D202（Phialocephala fortinii）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）SH均保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 深色有隔內(nèi)生真菌D202對(duì)立枯絲核菌的抑制作用研究

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法^[8]，測(cè)定菌株D202對(duì)立枯絲核菌的拮抗作用。由于生長(zhǎng)速度差異，采用先內(nèi)生真菌后絲核菌的錯(cuò)時(shí)培養(yǎng)方培進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，測(cè)量菌落半徑，計(jì)算抑制率、相對(duì)抑制效果。每個(gè)處理3次重復(fù)。

抑制率（%）=[（對(duì)照菌落半徑-對(duì)峙培養(yǎng)菌落半徑）/對(duì)照菌落半徑]×100%

相對(duì)抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率

采用菌絲生長(zhǎng)抑制法^[9]，測(cè)定菌株D202非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)四核菌生長(zhǎng)的抑制作用，過(guò)濾，收集發(fā)酵液后，添加到PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)絲核菌，采用十字交叉法測(cè)量病原菌的菌落直徑，計(jì)算菌株D202代謝產(chǎn)物中抑菌活性成分對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率。每個(gè)處理3次重復(fù)。

抑制率（%）=[（對(duì)照菌落半徑-抑制培養(yǎng)菌落半徑）/對(duì)照菌落半徑]×100%

1.3 深色有隔內(nèi)生真菌D202生理學(xué)特性研究

1.3.1 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。將D202菌落接種到PDA培養(yǎng)基上，分別在10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.2 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。碳源培養(yǎng)基配方改良PDA培養(yǎng)基，將不同碳源包括甘露醇、 蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖替代葡萄糖，制備不同碳源培養(yǎng)基碳源添加量為20 g/L，接種菌株D202后，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.3 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。氮源培養(yǎng)基為改良PDA中添加2 g氮源。供試氮源包括甘氨酸、硝酸鈣、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、酒石酸銨、硝酸銨，制備不同氮源培養(yǎng)基，氮源添加量為2 g/L接種菌株D202后，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.4 不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。用1 mol/L HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)改良PDA培養(yǎng)基pH為5、6、7、8、9，制備不同pH的改良PDA培養(yǎng)基，接種菌株D202后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株D202對(duì)立枯絲核菌的抑制作用

在對(duì)峙培養(yǎng)中，菌株D202可以有效抑制絲核菌的生長(zhǎng)（圖1），2個(gè)菌落未形成拮抗線，但可以判斷D202在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)代謝出抑菌活性成分，抑制絲核菌的生長(zhǎng)，生防菌株的作用機(jī)理包括重寄生、競(jìng)爭(zhēng)作用和代謝活性成分，而D202的抑菌機(jī)理主要可以代謝抑菌活性成分，D202對(duì)絲核菌的抑制率為67.25%，相對(duì)抑制效果3.54，在有效抑制絲核菌生長(zhǎng)的同時(shí)，自身生長(zhǎng)未受到明顯抑制。菌株D202的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物具有強(qiáng)烈的抑制絲核菌生長(zhǎng)的作用，其非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)絲核菌的抑制率為72.35%，D202非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性較好，高溫滅菌處理后抑菌率為50.15%，絲核菌在含有D202的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)很弱，菌絲生長(zhǎng)稀疏，氣生菌絲較多。

2.2 深色有隔內(nèi)生真菌D202生物學(xué)特性

2.2.1 溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響。由圖2可知，菌株D202在 10～35 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)的最佳溫度范圍20～30 ℃，可耐低溫，菌株在25 ℃下培養(yǎng)生長(zhǎng)速度最快，14 d后菌落直徑達(dá)到5.24 cm，低于10 ℃和高于35 ℃時(shí)，菌落生長(zhǎng)較慢。

2.2.2 碳源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響。由圖3可知，在所有供試碳源中，菌株D202均可生長(zhǎng)，對(duì)葡萄糖、蔗糖和淀粉的利用率較高，在碳源為葡萄糖時(shí)菌落生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)14 d后菌落直徑可達(dá)5.21 cm；橫向比較，菌株D202對(duì)甘露醇、乳糖和半乳糖的利用率較低。

2.2.3 氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響。由圖4可知，不同氮源對(duì)菌株D202生長(zhǎng)的影響較小。菌株可很好地利用各種有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮，對(duì)蛋白胨的利用率最高，培養(yǎng)14 d后菌落直徑可達(dá)到5.18 cm。該菌株對(duì)氮源無(wú)特殊要求。在缺乏氮源的改良PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，菌落依然生長(zhǎng)良好。

2.2.4 pH對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響。由圖5可知，在不同pH條件下，菌株D202均可生長(zhǎng)。在中性偏酸條件下，菌絲生長(zhǎng)迅速，菌落濃密旺盛，而偏堿性時(shí)菌株生長(zhǎng)受到一定的抑制作用。在pH為7時(shí)，培養(yǎng)14 d后菌落直徑可達(dá)5.19 cm，說(shuō)明該菌株的生長(zhǎng)環(huán)境偏酸，不喜好在偏堿性環(huán)境中生長(zhǎng)。

拮抗試驗(yàn)中D202對(duì)絲核菌的抑制率為67.25%，相對(duì)抑制效果3.54，其非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)絲核菌的抑制率為72.35%。上述結(jié)果表明，菌株D202及其代謝產(chǎn)物可有效地抑制立枯絲核菌的生長(zhǎng)，具有生防菌的開(kāi)發(fā)價(jià)值。生理學(xué)特性研究結(jié)果表明，當(dāng)內(nèi)生菌株D202生長(zhǎng)的碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，溫度為25 ℃，培養(yǎng)基pH為7時(shí)，菌落生長(zhǎng)最好。

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