李泌等

摘要[目的]擴(kuò)大鄂西地區(qū)稻瘟病菌菌庫(kù)，分析其群體結(jié)構(gòu)。[方法]收集鄂西不同地區(qū)2011年間的感病稻稈，分離保存稻稈上的穗頸瘟病菌，通過RAPD、repPot2PCR、REMAP 3種標(biāo)記對(duì)分離的菌株進(jìn)行分子標(biāo)記。[結(jié)果]從9個(gè)稻稈上共分離得到29個(gè)稻瘟病菌。遺傳多樣性分析結(jié)果表明，相似性水平在75%時(shí)， 2011年供試菌株可分為5個(gè)遺傳宗譜，宗譜3（7個(gè)菌株）和4（19個(gè)菌株）為優(yōu)勢(shì)宗譜，其余3個(gè)為稀有宗譜。[結(jié)論] 2011年鄂西地區(qū)稻瘟病菌由5個(gè)遺傳宗譜組成。

關(guān)鍵詞水稻稻瘟病菌；鄂西地區(qū)；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）14-04249-03

Genetic Diversity of Magnaporthe oryzae in Western Hubei Province in 2011

LI Mi， XU Xin et al（Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China， Key Laboratory of State Ethnic Affairs Commission for Biological Technology， College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan， Hubei 430074）

Abstract[Objective] To enlarge the physiological race library of Magnaporthe oryzae in Western Hubei Province， analyze the population structure. [Method] The Magnaporthe oryzae spores were isolated from the infected rice panicles， which were collected from western Hubei Province area in 2011. Cluster analysis of the test samples was conducted by RAPD， REMAP and repPot2PCR. [Result] 29 Magnaporthe grisea strains were isolated from 9 panicles. The result of cluster analysis showed there were 5 genetic lineages at similarity coefficient of 0.75. Lineages III and IV， which included 7 strains and 19 strains， respectively， were dominant lineage. [Conclusion]Magnaporthe oryzae in West Hubei Province in 2011 was divided into 5 genetic lineages.

Key wordsMagnaporthe oryzae； Western Hubei Province； Genetic diversity

稻瘟病是由Magnaporthe oryzae引起的一類真菌病害，是水稻的三大病害之一。稻瘟病具有發(fā)生地域廣、流行頻率高、危害影響重等特點(diǎn)。防治稻瘟病的方法主要有藥物防治和抗性品種篩選2種方法，受環(huán)境和成本等因素的制約，目前主要以選擇抗性品種為主。但由于稻瘟病生理小種遺傳和致病的多樣性，同一水稻產(chǎn)區(qū)抗性品種在推廣種植數(shù)年之后抗性會(huì)逐漸減弱，甚至完全喪失[1-2]。因此，利用現(xiàn)有抗性基因和發(fā)現(xiàn)新的抗性基因，收集生理小種，調(diào)查演變趨勢(shì)，對(duì)合理布局抗病品種，長(zhǎng)期、有效地防治稻瘟病具有重要意義。

鄂西地區(qū)地處武陵山區(qū)北端。該地區(qū)屬于中亞熱帶溫濕季風(fēng)氣候，霧露多、日照少、濕度大、雨熱同季，降水分布不均勻，極易引起稻瘟病的發(fā)生[3]。同時(shí)由于境內(nèi)海拔高低懸殊，氣候垂直差異明顯，地形地貌復(fù)雜，水稻種植的品種和時(shí)間也存在明顯差異，使得該地區(qū)稻瘟病菌生理小種具有品種豐富、組成復(fù)雜、致病力強(qiáng)等特點(diǎn)，是研究稻瘟病的代表性地區(qū)[4]。恩施地區(qū)常年水稻種植面積達(dá)4萬(wàn)hm2，據(jù)統(tǒng)計(jì)因稻瘟病危害常年損失10%～20%，嚴(yán)重的可達(dá)40%～50%，局部農(nóng)田甚至顆粒無(wú)收[5]。

目前，對(duì)于鄂西地區(qū)稻瘟病的研究多集中在水稻抗病品種的選育上，對(duì)稻瘟病菌生理小種多樣性的研究相對(duì)缺乏[6-8]。筆者前期收集了2010年鄂西地區(qū)的稻瘟病菌，構(gòu)建了該地區(qū)稻瘟病菌生理小種菌庫(kù)，分析了稻瘟病菌生理小種的組成結(jié)構(gòu)[9]。筆者通過收集的2011年稻瘟病菌，采用3種不同分子標(biāo)記分析其遺傳結(jié)構(gòu)，為鄂西地區(qū)水稻抗病品種的選育和布局提供依據(jù)和參考。

1材料與方法

1.1材料水稻感病稻稈均取自湖北恩施自治州5個(gè)不同地區(qū)，以水稻穗頸部發(fā)病為主。每個(gè)感病植株取7個(gè)稻稈，保留發(fā)病部位，將稻稈截至7 cm左右，記錄品種、地點(diǎn)、日期。材料取回后置于37 ℃烘箱中3 d后保存于4 ℃冰箱中。

1.2稻瘟病菌單孢的分離

1.2.1稻稈的處理。保存的稻稈于70%乙醇浸泡2 min后水洗3～5次。取滅菌平皿（95 mm×15 mm），底層鋪單層紗布，一端用吸水濾紙做成枕頭狀墊高。將洗好的稻稈傾斜置于平皿中，加適量無(wú)菌水保持平皿底層濕潤(rùn)。在平皿上做好相應(yīng)標(biāo)記，置27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，同一類型的稻稈每次培養(yǎng)3個(gè)。

1.2.2單孢的分離。配制1%氯霉素的水瓊脂平板，用洗耳球輕輕吹打已長(zhǎng)滿孢子的稻稈，使孢子均勻?yàn)⒙湓谏鲜雠囵B(yǎng)基上。將平皿倒扣在顯微鏡載物臺(tái)上，10倍鏡下觀察。調(diào)整視野使視野中只有一個(gè)孢子，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡用已蘸有印泥的針頭在平皿上標(biāo)記出相應(yīng)位置。用接種針將標(biāo)記位置的孢子挑出來(lái)轉(zhuǎn)移到燕麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個(gè)稻稈挑取7個(gè)單孢。

1.3稻瘟病菌的保存將滅菌濾紙條均勻覆蓋在燕麥培養(yǎng)基上，每個(gè)平皿里放約4個(gè)濾紙條。將分離純化后的菌株接種在覆蓋濾紙條的培養(yǎng)基中，放入27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌長(zhǎng)滿平皿，將濾紙條挑入5 ml離心管中并置于內(nèi)含硅膠的玻璃干燥器中干燥30～60 d。用封口膜包好離心管管口，將干燥的菌株放在-80 ℃冰箱中保存待用。

1.4稻瘟病菌的形態(tài)觀察將分離的稻瘟病菌統(tǒng)一接種到燕麥培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后用照相機(jī)拍照記錄每個(gè)菌株的菌落形態(tài)。根據(jù)每個(gè)菌株的氣生菌絲發(fā)達(dá)程度、菌體顏色、菌體邊緣等特點(diǎn)，對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的初步分類。

1.5供試菌株DNA的分子標(biāo)記擴(kuò)增將菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，收集菌絲提取基因組DNA[10]，運(yùn)用RAPD、repPot2和REMAP分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)[11-14]。使用NTSYS軟件的UGMPA算法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析[15]。

2結(jié)果與分析

2.1感病材料稻瘟病菌分離結(jié)果將不同年份間的材料按照編號(hào)和分離得到的單個(gè)菌落依次統(tǒng)計(jì)，從2011年的9個(gè)稻稈上成功分離得到29個(gè)菌株，編號(hào)為A1～A29（表1）。

2.2稻瘟病菌的分子多態(tài)性分析用篩選出的16條RAPD標(biāo)記，3條ISSR標(biāo)記，以及1對(duì)Pot2標(biāo)記（表2）對(duì)分離的菌株DNA分別進(jìn)行RAPD、REMAP、repPot2PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，多數(shù)菌株能擴(kuò)增出3～8條帶，擴(kuò)增的片段大小為0.2～5.0 kb（圖1）。所有供試菌群由上述引物通過PCR擴(kuò)增共得到54條具有多態(tài)性的條帶。把條帶擴(kuò)增情況轉(zhuǎn)換成二進(jìn)制數(shù)據(jù)，利用NTSYS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析（圖2）。UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，該套分子標(biāo)記可以將2011年所有供試材料進(jìn)行有效區(qū)分和聚類。相似性水平在75%時(shí)，可將2011年供試菌株分為5個(gè)遺傳宗譜。其中宗譜3包含7個(gè)菌株；宗譜4包含19個(gè)菌株，為優(yōu)勢(shì)宗譜；宗譜1、宗譜2和組宗譜5僅包含1個(gè)菌株，為稀有宗譜。（圖2）。

3討論

對(duì)稻瘟病的遺傳結(jié)構(gòu)和聚類分析多采用RAPD、REMAP或repPot2PCR等分子標(biāo)記單獨(dú)分型[16-18]。該研究將3種分子標(biāo)記相結(jié)合，聚類分析結(jié)果顯示，該方法可有效地將穗頸瘟進(jìn)行區(qū)分和分類，從而建立了一套鑒定鄂西地區(qū)水稻穗頸瘟的分子標(biāo)記體系。此后每年采集的穗頸瘟材料都可通過該套分子標(biāo)記體系進(jìn)行鑒定和聚類，從而有效研究該地區(qū)穗頸瘟的動(dòng)態(tài)變化。

利用該套分子標(biāo)記對(duì)2011年菌群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，體現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)譜系和稀有譜系共存的特征。與2010年菌群結(jié)構(gòu)[9]相比，2年間遺傳結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化。

由于2010和2011年采集的穗頸瘟病菌在宿主材料（水稻品種）上差異較大，可能會(huì)影響到其組成和結(jié)構(gòu)。因此，下一步研究擬采用水稻稻瘟病抗性標(biāo)準(zhǔn)材料[19-20]，在孕穗期接種穗頸瘟病菌，進(jìn)一步調(diào)查其毒性，分析該地區(qū)穗頸瘟的毒性與其動(dòng)態(tài)變化的關(guān)系，從而為該地區(qū)水稻抗病品種的選育和布局提供依據(jù)和參考。

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