陳旭玉 甘炳春 馮錦東

摘要 [目的]明確高良姜葉枯病病原菌。 [方法] 病原菌從高良姜感病組織上分離并依據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定，病原菌的鑒定主要通過形態(tài)鑒定和ITS序列分析。[結(jié)果] 高良姜葉枯病病原菌確定為可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae），屬子囊菌門（Ascomycota），座囊菌綱（Dothideomycetes），葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales），葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae），毛色二孢屬（Lasiodiplodia）。 [結(jié)論]首次報(bào)道高良姜葉枯病病原菌為可可毛色二孢。

關(guān)鍵詞 高良姜；葉斑病； 可可毛色二孢

中圖分類號(hào) S573 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）16-05031-02

高良姜（Alpinia officinarum Hance）屬姜科山姜屬多年生草本植物，以根莖入藥，是一種常見的南藥[1]。其性熱、味辛，具有溫中、散寒、理氣、止痛的功效[2]。高良姜主產(chǎn)于廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、海南、云南等地，在海南陵水、萬寧、儋州等都有栽培[3-4]。海南種植的幾塊高良姜基地都發(fā)現(xiàn)葉枯病，嚴(yán)重影響了高良姜的發(fā)展。發(fā)病的葉片多從葉尖葉緣開始發(fā)病，病斑近圓形或不規(guī)則形，灰褐色，干斑病斑黃褐色，中央有灰白色，病健交界處有明顯的黃色暈圈和較寬的褐色分界線。嚴(yán)重者整個(gè)葉片變黃干枯（圖1）。目前國內(nèi)外尚未見對(duì)高良姜葉枯病的研究，為了明確葉枯病的病原菌和有效控制葉枯病的蔓延，筆者對(duì)高良姜葉枯病病原菌進(jìn)行研究，旨在為高良姜葉枯病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 從海南省萬寧市藥用植物研究所海南分所南藥園等多個(gè)地點(diǎn)采集具有典型癥狀的高良姜葉枯病病葉，組織分離法獲得菌株，純化后，轉(zhuǎn)入試管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化。 將具有典型癥狀的高良姜葉片用清水清洗干凈，用75%乙醇浸泡1 min，用無菌水沖洗3～4次，再浸入10%次氯酸鈉中消毒2 min，用無菌水沖洗3～4次。用解剖刀切下病健交界處在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取形態(tài)不同的單菌落于新培養(yǎng)基上培養(yǎng)。采用瓊脂平板稀釋純化法進(jìn)行純化，再將純化的菌株分別轉(zhuǎn)入試管斜面保存以供測定。

1.2.2 病原菌致病性測定。 將菌株的菌絲塊分別接種于健康無病的葉片，采用刺傷的接種方法，接種后保濕。以接種無菌的瓊脂塊作為對(duì)照，逐日觀察并記錄其發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察。將柯赫法則驗(yàn)證后的菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，觀察菌落的顏色和形狀，用顯微鏡觀察分生孢子梗、分生孢子的形態(tài)。

1.2.4 病原菌分子鑒定。使用TIANGEN生化科技有限公司植物基因組試劑盒（DP320.02）進(jìn)行真菌DNA提取，具體步驟參照其說明書。以真菌DNA為模板，ITS1/ITS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其序列為：擴(kuò)增反應(yīng)體系為：模板（真菌DNA） 0.5～1.0 μl，ITS1（10 μm）1 μl， ITS4（10 μm） 1 μl，2× Master Mix 12.5 μl，ddH2O 10 μl，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的致病性 通過菌塊接種法，3 d后發(fā)現(xiàn)該病原菌浸染的高良姜表現(xiàn)出與田間發(fā)病植株相同的癥狀，并從中再次分離到該病原菌。而空白對(duì)照無癥狀出現(xiàn)（圖2）。

2.2 病原菌鑒定 高良姜葉枯病原菌序列與NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上相似序列比對(duì)結(jié)果表明，該菌株與Lasiodiplodia theobromae（JX275790）的序列相似性為99%，結(jié)合形態(tài)特征，將該病原菌鑒定為可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）。屬子囊菌門（Ascomycota），座囊菌綱（Dothideomycetes），葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales），葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae），毛色二孢屬（Lasiodiplodia），病原菌孢子形態(tài)見圖3。

3 結(jié)論與討論

目前對(duì)高良姜的道地性、化學(xué)成分、藥理作用等方面開

展了大量研究，但尚無高良姜病害的研究報(bào)道。為明確該病病原菌和有效控制病害的發(fā)生，該研究對(duì)病原菌進(jìn)行分離并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和DNA分子序列將該病原鑒定為可可毛色二孢?？煽擅呤浅Ｒ姷牟≡?，常引起枝枯病、裂皮病，褐腐病、果腐病等[5-9]，該研究首次報(bào)道高良姜葉枯病病原菌確定為可可毛色二孢，為有效防治該病害和深入研究提供基礎(chǔ)。

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