李季 黃天帶 華玉偉等

摘 要 為了同時(shí)檢測(cè)橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)基因胚狀體和葉片中含有的多個(gè)目標(biāo)基因序列，并排除擴(kuò)增結(jié)果的假陰性，利用正交試驗(yàn)首次建立了橡膠樹(shù)管家基因（HbActin）、目標(biāo)基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II（NptII）基因和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因的多重PCR檢測(cè)體系。利用2種酶（PCR Mix酶和Taq酶）對(duì)18個(gè)轉(zhuǎn)基因胚狀體和葉片進(jìn)行單一引物PCR擴(kuò)增和多重PCR檢測(cè)。結(jié)果表明：多重PCR檢測(cè)結(jié)果與單一PCR結(jié)果完全一致，且多重PCR體系帶型清晰，無(wú)非特異性擴(kuò)增，更易讀取。多重PCR檢測(cè)系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確并且高效等特點(diǎn)，只需要進(jìn)行一個(gè)反應(yīng)就可以檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)基因序列，因而在轉(zhuǎn)基因分子鑒定上具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值與潛力。

關(guān)鍵詞 多重PCR；橡膠樹(shù)；轉(zhuǎn)基因胚狀體；轉(zhuǎn)基因葉片；分子鑒定

中圖分類號(hào) Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是轉(zhuǎn)基因分子檢測(cè)中最普遍的方法之一，其檢測(cè)多為單一靶位點(diǎn)的擴(kuò)增，對(duì)多目標(biāo)基因而言，需要進(jìn)行多次的PCR反應(yīng)，不僅耗時(shí)耗力，成本也較高。多重PCR技術(shù)最初由Chamberlain等[1]提出，是指在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行多個(gè)靶位點(diǎn)擴(kuò)增的PCR技術(shù)。因其具操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)成本低、可加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于人類及家禽疾病的診斷[1-4]、植物純度及品種鑒定[5-8]、轉(zhuǎn)基因成分與定量檢測(cè)[9-19]等。不過(guò)，多重PCR要求多個(gè)不同的引物能在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行特異性擴(kuò)增，因此需要對(duì)影響其擴(kuò)增效果的因素進(jìn)行優(yōu)化，主要優(yōu)化因素有循環(huán)參數(shù)、反應(yīng)體積、反應(yīng)體系、引物間的堿基配對(duì)等[20]。

本研究以轉(zhuǎn)基因橡膠樹(shù)胚狀體和葉片為材料，對(duì)多重PCR反應(yīng)體系中的退火溫度、引物濃度比例及PCR反應(yīng)體系的組分進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，首次建立了橡膠樹(shù)管家基因引物HbActin-P1/P2與載體特異基因引物Npt-f/r和Gus-f/r的PCR Mix酶以及Taq酶的多重PCR檢測(cè)體系，并與單一引物擴(kuò)增的結(jié)果對(duì)比，驗(yàn)證了優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系的準(zhǔn)確性及靈敏性，為后續(xù)外源基因的快速檢測(cè)工作提供了便利。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 轉(zhuǎn)基因材料與質(zhì)粒材料 攜帶有外源NptII基因和GUS報(bào)告基因的橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)基因胚狀體及轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定期葉片由本實(shí)驗(yàn)室提供。表達(dá)載體pCAMBIA2301質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室留存。

1.1.2 試劑 Taq酶，dNTPs，RNaseA等購(gòu)自Fermentas公司，PCR Mix酶[2×Eco Taq PCR SuperMix（+dye）]購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DL 2 000 Marker購(gòu)自大連Takara公司，NptII、GUS基因以及橡膠樹(shù)管家基因HbActin的引物由深圳華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 單一引物PCR擴(kuò)增 來(lái)源于NptII和GUS基因的引物Npt-f/r和Gus-f/r序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)李季等[21]報(bào)道，橡膠樹(shù)管家基因HbActin的引物HbActin-P1/P2序列HbActin-P1：CACCACTCAGCA

CAATGTTACC；HbActin-P2：GATTCCGTTGCCCAG

AAGTC，片段大小為154 bp。PCR擴(kuò)增采用15 μL 反應(yīng)體系，PCR Mix酶擴(kuò)增體系為2×PCR Mix 7.5 μL，上下引物各0.3μL。Taq酶擴(kuò)增體系：10×Taq Buffer 1.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.15 μL，10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，2 μL上述DNA溶液，用滅菌水補(bǔ)足至15 μL。模板參照李季等[21-22]報(bào)道的方法，提取18個(gè)轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA。HbActin-P1/P2引物最佳復(fù)性溫度為60 ℃，復(fù)性40 s，72 ℃延伸時(shí)間為30 s，其余2對(duì)引物的最佳復(fù)性溫度、延伸時(shí)間及PCR反應(yīng)過(guò)程中的所用對(duì)照組與李季等[22]報(bào)道相同。HbActin-P1/P2引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余引物用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.2.2 多重PCR最佳退火溫度的確定 PCR Mix酶和Taq酶的多重PCR檢測(cè)體系同單一引物PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，3對(duì)正反向引物各加0.3 μL，模板為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株Tj200863-2的葉片DNA[22]。根據(jù)引物的Tm值，選擇中間溫度為58 ℃，上下波動(dòng)3 ℃，PCR反應(yīng)在eppendorf Mastercycler gradient PCR儀器中進(jìn)行，PCR儀自動(dòng)生成12個(gè)梯度退火溫度，分別是55.0、55.1、55.4、56.0、56.7、57.4、58.3、59.1、59.9、60.5、61.0、61.3 ℃。

1.2.3 多重PCR最佳引物濃度的確定 根據(jù)1.2.2確定的最佳退火溫度，2種酶15 μL的反應(yīng)體系中，其余成分濃度保持不變，采用L4（23）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定PCR反應(yīng)體系中3對(duì)引物濃度比例。

1.2.4 多重PCR最佳組分濃度的確定 根據(jù)1.2.2和1.2.3中確定的最佳退火溫度以及3對(duì)引物最適宜的濃度，對(duì)Taq酶PCR體系中各組分（Mg2+，dNTPs和Taq酶）濃度進(jìn)行優(yōu)化篩選，同樣設(shè)計(jì)L4（23）正交試驗(yàn)。

1.2.5 多重PCR體系的驗(yàn)證 分別選取18株橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因葉片DNA為材料，利用上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行PCR Mix酶和Taq酶的多重PCR檢測(cè)，檢測(cè)方法同單一PCR，多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同退火溫度對(duì)多重PCR的影響

2.2 不同引物濃度對(duì)多重PCR的影響

2.3 不同PCR組分對(duì)多重PCR的影響

2.4 單一PCR擴(kuò)增與多重PCR擴(kuò)增結(jié)果比較

2.4.2 單一PCR與多重PCR（Taq酶）的擴(kuò)增結(jié)果比較 根據(jù)上述優(yōu)化的Taq酶的多重PCR擴(kuò)增體系，結(jié)合單一PCR擴(kuò)增對(duì)隨機(jī)挑選的18個(gè)轉(zhuǎn)基因胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。Taq酶的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果帶型清晰，3對(duì)引物所擴(kuò)增條帶亮度一致并與單一PCR的擴(kuò)增結(jié)果相同，且無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，結(jié)果比單引物PCR擴(kuò)增更易讀取且準(zhǔn)確。

3 討論與結(jié)論

多重PCR可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因的片段，操作簡(jiǎn)單，速度快，費(fèi)用低，同時(shí)也大大降低了產(chǎn)物污染的可能性[23-24]。但成功的多重PCR試驗(yàn)與周密的試驗(yàn)設(shè)計(jì)是分不開(kāi)的，因?yàn)樵谝粋€(gè)反應(yīng)體系中，不同目的片段的擴(kuò)增是相互競(jìng)爭(zhēng)的，引物組合、引物濃度、退火溫度等都會(huì)影響多重PCR的結(jié)果[25]，而反應(yīng)體積、不同延伸溫度、循環(huán)次數(shù)對(duì)其擴(kuò)增效果影響較小[20]。因此在建立多重PCR體系時(shí)，針對(duì)影響較大的因素進(jìn)行優(yōu)化十分必要[23，26]。本研究認(rèn)為利用PCR或多重PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株外源基因的存在時(shí)，要確保已提取到的DNA質(zhì)量及DNA提取物中不含抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，因此有必要進(jìn)行內(nèi)源基因的PCR擴(kuò)增[13]。但單獨(dú)進(jìn)行DNA質(zhì)量的檢測(cè)或者PCR擴(kuò)增費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，本研究創(chuàng)建的多重PCR體系中引入了橡膠樹(shù)管家基因HbActin，以評(píng)估模板DNA質(zhì)量以及PCR擴(kuò)增反應(yīng)的效果，同時(shí)以宿主內(nèi)部的特異基因作為對(duì)照，有效避免了由于DNA提取質(zhì)量或試驗(yàn)操作失誤所造成的假陰性問(wèn)題，提高檢測(cè)效率[27]。轉(zhuǎn)基因外源基因成分檢測(cè)時(shí)，NptII基因和GUS基因是常見(jiàn)的檢測(cè)項(xiàng)目。在多重PCR體系中，引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要，一般要注意引物長(zhǎng)度不宜過(guò)長(zhǎng)；引物之間應(yīng)減少同源性；引物間最好有相近的退火溫度；通過(guò)調(diào)整引物濃度確保不同目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率一致等[26]。此前，筆者針對(duì)這2個(gè)基因均設(shè)計(jì)了相應(yīng)引物，單一引物擴(kuò)增時(shí)兩者擴(kuò)增效果較好，擴(kuò)增片段大小差異較大，分別是453 bp和1 203 bp，而橡膠樹(shù)管家基因HbActin基因片段大小僅為154 bp，三者通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳很容易區(qū)分，為此，本研究將這3對(duì)引物同時(shí)放在多重PCR體系中，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示三者存在競(jìng)爭(zhēng)，擴(kuò)增條帶清晰，可有效避免檢測(cè)過(guò)程中假陽(yáng)性的出現(xiàn)，進(jìn)而提高檢測(cè)效率。根據(jù)郝玉芹等[28]和李政利等[29]的正交試驗(yàn)針對(duì)引物退火溫度、引物濃度比例及PCR組分等進(jìn)行優(yōu)化，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，引物濃度比例在2種酶體系中不同，而PCR組分在Taq酶體系中與單一PCR相同。王鳳格等[30]在建立玉米高通量多重PCR擴(kuò)增體系時(shí)，選擇與穩(wěn)定有效的單一PCR反應(yīng)相同的條件，并遵循引物組合的一般原則，直接應(yīng)用到多重PCR體系中，無(wú)需進(jìn)行繁瑣的優(yōu)化，同樣可以得到正常的擴(kuò)增結(jié)果。Ma等[31]和劉正斌等[23]也提出這樣的方法能取得令人滿意的結(jié)果。但本研究中2個(gè)酶的多重PCR體系中最佳退火溫度均與單一引物PCR體系不同，且Taq酶體系中的引物濃度比例與單一PCR有所差別。因此，從本研究的結(jié)果可以得知，即便比較成熟的多重PCR反應(yīng)體系，也要根據(jù)不同的模板、酶以及引物對(duì)實(shí)驗(yàn)條件加以調(diào)整優(yōu)化，以保證結(jié)果的特異性和可靠性，這與吳 影等[15]、胡毅玲等[32]、邵碧英等[11，33]報(bào)道的結(jié)果一致。而對(duì)于其他目的基因的檢測(cè)，由于在多重PCR體系中各引物的交叉結(jié)合使得非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的可能性十分小，因此，理論上只要不同引物之間互補(bǔ)的堿基不多，片段大小不太接近，退火溫度相近，單一PCR檢測(cè)時(shí)穩(wěn)定性好，引物對(duì)的數(shù)量可以不限[6， 23， 26]。

在進(jìn)行大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)過(guò)程中，PCR Mix酶的擴(kuò)增優(yōu)越性要高于Taq酶，而且操作更為簡(jiǎn)便，但在擴(kuò)增過(guò)程中存在的非特異性擴(kuò)增可能會(huì)造成假陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn)，故在前期大規(guī)模檢測(cè)時(shí)可以采取PCR Mix酶擴(kuò)增，挑選出可能的陽(yáng)性胚狀體或者單株，而后利用保真度更高的Taq酶加以驗(yàn)證。因此，本研究針對(duì)早期的胚狀體和轉(zhuǎn)基因植株葉片均進(jìn)行了2種酶的多重PCR體系的優(yōu)化，并取得較好的效果，同單一引物PCR擴(kuò)增結(jié)果比較，其檢測(cè)效率明顯提高，結(jié)果也更可靠。

綜上所述，本研究通過(guò)比較多重PCR擴(kuò)增與單一引物PCR擴(kuò)增可知，兩者結(jié)果完全一致，且多重PCR結(jié)果更為清晰，無(wú)非特異性擴(kuò)增，結(jié)果更準(zhǔn)確。因此將多重PCR方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因橡膠樹(shù)外源基因的檢測(cè)是完全可行的。

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