胡宏海　張泓

摘 要：對無硝干腌肉制品中鋅-原卟啉Ⅸ形成的研究進(jìn)展進(jìn)行了較為系統(tǒng)的闡述。鋅-原卟啉Ⅸ是無硝干腌肉制品中的主要紅色色素，研究結(jié)果表明其生成量與工藝條件密切相關(guān)，通過優(yōu)化工藝參數(shù)可促進(jìn)肉制品中鋅-原卟啉Ⅸ，但其形成機(jī)制還尚待進(jìn)一步闡明。

關(guān)鍵詞：干腌肉制品； 亞硝基肌紅蛋白；鋅-原卟啉IX；硝酸鹽

Recent Progress in the Research of Zinc Protoporphyrin IX Formation in Nitrite-Free Dry-Cured Meat Products

HU Hong-hai， ZHANG Hong*

（Institute of Agro-products Processing Science and Technology， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： This paper systematically reviews recent progress in the research of zinc protoporphyrin IX formation in nitrite-free dry-cured meat products. Zinc protoporphyrin Ⅸ is the principal red pigment in dry cured meat products without nitric， and its formation has been considered closely related to processing conditions. Under optimized process parameters zinc protoporphyrin Ⅸ formation can be promoted in meat products， but its formation mechanism remains to be further elucidated.

Key words： dry-cured meat products； nitrosylmyoglobin； Zn-protoporphyrin IX； nitrate

中圖分類號：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）05-0037-04

肉與肉制品的色澤是重要的品質(zhì)評價指標(biāo)，直接影響消費(fèi)者對產(chǎn)品適口性的感官認(rèn)知。在肉制品腌制過程中添加硝酸鹽和亞硝酸鹽可形成最佳的色澤。通常，腌肉制品的紅色色澤源于亞硝基肌紅蛋白，是在內(nèi)源性酶或還原劑的作用下，亞硝酸鹽與肌肉中的肌紅蛋白反應(yīng)生成的。但是，肉制品中添加的亞硝酸鹽在加工和烹飪過程中會生成亞硝胺，對人體健康有害[1]。因此，如何使用替代物以獲得肉制品的穩(wěn)定色澤成為肉品加工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]。由于帕瑪火腿等干腌肉制品在腌制過程中不添加硝酸鹽或亞硝酸鹽的條件下亦可形成穩(wěn)定的紅色色澤[3-6]，許多學(xué)者就帕瑪火腿等無硝干腌肉制品中的色澤形成進(jìn)行了廣泛的研究[7-11]。最近研究發(fā)現(xiàn)，帕瑪火腿中的亮紅色是由鋅-原卟啉Ⅸ所引起的[12-15]。

1 鋅-原卟啉Ⅸ的化學(xué)特性

源自意大利北部的傳統(tǒng)干腌火腿被稱作帕瑪火腿，以整豬腿為原料，僅添加主要成分為氯化鈉的海鹽，其穩(wěn)定的亮紅色是在不添加硝酸鹽或亞硝酸鹽的情況下產(chǎn)生的。Wakamatsu等[12]采用掃描電鏡/能量彌散X光儀（scanning electron microscopy with energy dispersive

X-ray，SEM-EDX）分析發(fā)現(xiàn)，帕瑪火腿中紅色色素的固相提取純化物中含有鋅而不含鐵。結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果，可推斷帕瑪火腿中的紅色色素物質(zhì)是鋅-原卟啉Ⅸ，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。鋅-原卟啉Ⅸ與大家熟知的肌紅蛋白衍生物不同，對光穩(wěn)定性強(qiáng)。Parolari等[16]報道無亞硝酸鹽干腌肉制品會產(chǎn)生親脂性的穩(wěn)定紅色色素，其疏水性隨著成熟時間而增加。最新研究結(jié)果表明，鋅-原卟啉Ⅸ不僅存在于帕瑪火腿中，也存在于其他肉制品中。通過比較帕瑪火腿和伊比利亞火腿提取物的質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)，兩者均檢出同樣的鋅-原卟啉Ⅸ特征峰，由此可見，鋅-原卟啉Ⅸ是不添加硝酸鹽/亞硝酸鹽的干腌肉制品色澤的重要貢獻(xiàn)者[17-20]。

圖 1 鋅-原卟啉Ⅸ的化學(xué)結(jié)構(gòu)[12]

Fig.1 Structure of zinc protoporphyrin IX[12]

2 鋅-原卟啉Ⅸ形成的研究進(jìn)展

2.1 模擬體系中培養(yǎng)條件對鋅-原卟啉Ⅸ形成的影響

Wakamatsu等[14]在模擬體系中探討了各種培養(yǎng)條件對鋅-原卟啉Ⅸ形成的影響。模擬體系由0.1%肌紅蛋白和20%豬肉勻漿物組成，無氧條件下25 ℃培養(yǎng)反應(yīng)一定時間后，測定其75%丙酮萃取液的熒光強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模擬體系中的鋅-原卟啉Ⅸ的生成量隨著反應(yīng)時間的增加而增加。在添加疊氮化鈉、抗生素以及乙基汞硫代水楊酸鈉等抑菌劑的條件下，也能形成鋅-原卟啉Ⅸ。同時，經(jīng)一定溫度和時間的預(yù)熱處理后，肌肉勻漿物中的鋅-原卟啉Ⅸ生成量降低。以上結(jié)果表明，無氧條件有利于不添加硝酸鹽或亞硝酸鹽的肉制品中鋅-原卟啉Ⅸ的形成，同時外源酶和微生物也與鋅-原卟啉Ⅸ的形成有關(guān)。

圖 2 無氧培養(yǎng)時間對鋅-原卟啉Ⅸ生成的影響[17]

Fig.2 Effects of anaerobic incubation time on the formation of Zinc Protoporphyrin IX[17]

2.3 酸的種類、pH值及微生物對無硝色拉米中鋅-原卟啉Ⅸ形成的影響

使用不同種類的有機(jī)酸調(diào)節(jié)豬肉勻漿物的pH值后，再加入抗生劑培養(yǎng)反應(yīng)一定時間，測定其中鋅-原卟啉Ⅸ的生成量，同時對培養(yǎng)反應(yīng)后的菌相變化進(jìn)行了解析。同時，使用豬肘肉為原料制作色拉米，探討了添加有機(jī)酸對鋅-原卟啉Ⅸ形成、色澤、微生物菌相的影響。研究結(jié)果表明，不同的有機(jī)酸種類、pH值條件下，鋅-原卟啉Ⅸ的形成量不同。通過添加有機(jī)酸，可促進(jìn)色拉米中鋅-原卟啉Ⅸ的形成，改善其色澤，同時影響微生物菌相變化。由此可見，通過有機(jī)酸和pH值的有機(jī)結(jié)合，調(diào)節(jié)肉制品中菌群結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)無硝肉制品中鋅-原卟啉Ⅸ的形成，改善肉制品色澤。

2.4 一氧化氮（NO）對鋅-原卟啉Ⅸ形成的影響

已有研究表明，添加亞硝酸鹽等腌制劑的肉制品中未發(fā)現(xiàn)鋅-原卟啉Ⅸ[17，21-22]，這可能是由于亞硝酸鹽在肉制加工過程中會形成一氧化氮（NO）所致，但其抑制機(jī)理尚未闡明。Grossi等[23]發(fā)現(xiàn)在模擬體系中添加亞硝酸鹽會抑制鋅-原卟啉Ⅸ的形成，同時認(rèn)為鋅-原卟啉Ⅸ是經(jīng)由原卟啉Ⅸ產(chǎn)生的，而非來自于血紅素。通過驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加SNAP或DETA NONOate等一氧化氮供體可顯著抑制鋅-原卟啉Ⅸ和原卟啉Ⅸ的形成（圖3），且由于DETA NONOate所產(chǎn)生的一氧化氮量大于SNAP，因此DETA NONOate對鋅-原卟啉Ⅸ和原卟啉Ⅸ生成的抑制效果較強(qiáng)[24]。通常認(rèn)為亞鐵螯合酶（Ferrochelatase）可促進(jìn)鐵和鋅與原卟啉Ⅸ發(fā)生螯合反應(yīng)，NO對鋅-原卟啉Ⅸ和原卟啉Ⅸ生成的抑制作用可能是由NO阻害亞鐵螯合酶活性引起的，其詳細(xì)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

圖 3 一氧化氮對鋅-原卟啉Ⅸ和原卟啉Ⅸ形成的影響[26]

Fig.3 Effect of nitric oxide on the formation of zinc protoporphyrin IX and protoporphyrin IX in model solutions[26]

2.5 酶觸反應(yīng)及非酶觸反應(yīng)對鋅-原卟啉Ⅸ形成的影響

Becker等[25]系統(tǒng)研究了由肌紅蛋白、原卟啉生成鋅-原卟啉Ⅸ的過程中，不同因素對酶促反應(yīng)及非酶促反應(yīng)速率的影響，以期揭示鋅-原卟啉Ⅸ形成的分子機(jī)理，開發(fā)新型無硝干腌肉制品加工技術(shù)。帕瑪火腿中參與金屬轉(zhuǎn)移反應(yīng)的金屬離子包括鋅、鐵等，肌肉和未經(jīng)調(diào)理的肉品中Zn2+、Fe2+及Fe3+的含量很低。通常，鋅、鐵等金屬離子會和肌肉中蛋白質(zhì)結(jié)合，同時在螯合劑的調(diào)控作用下，金屬轉(zhuǎn)移反應(yīng)會被促進(jìn)或阻止。磷酸鹽是常用的肉品加工添加劑，亦是肉中自由金屬離子的強(qiáng)力螯合劑，研究表明磷酸鹽可促進(jìn)肌肉勻漿和帕瑪火腿中鋅-原卟啉Ⅸ的形成。而EDTA作為Zn2+的強(qiáng)力螯合劑，會與其發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，限制Zn2+的轉(zhuǎn)移，從而阻害鋅-原卟啉Ⅸ的形成。適當(dāng)濃度的食鹽可促進(jìn)肌肉勻漿中鋅-原卟啉Ⅸ的形成，較高濃度的食鹽會完全阻止鋅-原卟啉Ⅸ的形成。另外，在丙酮：水溶液系統(tǒng)中∶考察了基于非酶促反應(yīng)的鋅-原卟啉Ⅸ的形成過程，發(fā)現(xiàn)該過程是一個可逆反應(yīng)，其二階速率常數(shù)為0.63 mol/（L·s（35 ℃）），所需活化能為98 kJ mol/L。同時，通過添加Pb（II）或

N-methylmesoporphyrin等亞鐵螯合酶抑制劑考察了亞鐵螯合酶對鋅-原卟啉Ⅸ形成的作用，結(jié)果表明，酶促反應(yīng)是肉品腌制前期中鋅-原卟啉Ⅸ形成的主要途徑，但隨著酶的失活，非酶促反應(yīng)變得更加重要。同時發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽既可抑制酶促反應(yīng)亦可抑制非促酶反應(yīng)，從而阻害鋅-原卟啉Ⅸ的形成，其原因可能是亞硝酸鹽或由亞硝酸鹽與肌紅蛋白反應(yīng)所形成的一氧化氮可阻害作為酶促反應(yīng)基質(zhì)的鐵-原卟啉Ⅸ發(fā)生分離，或者在非酶促反應(yīng)過程中與Zn（II）發(fā)生反應(yīng)。

2.6 蛋白質(zhì)水解對鋅-原卟啉Ⅸ形成的影響

Grossi等[25]利用高分辨核磁共振儀檢測火腿提取物的成分變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在帕瑪火腿的成熟過程中，甘油、游離氨基酸等含量不斷增加，這是由于火腿中存在脂肪水解酶和蛋白水解酶所致[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，即使在火腿成熟后期，內(nèi)源性組織蛋白酶仍有活性，可引起蛋白質(zhì)水解。同時發(fā)現(xiàn)，伴隨著火腿中小分子肽的增加，鋅-原卟啉Ⅸ的生成量也不斷增大。電子自旋共振（electron paramagnetic resonance，EPR）檢測發(fā)現(xiàn)，火腿生產(chǎn)初期，高氧肌紅蛋白的濃度較高，隨著成熟時間的推移，高氧肌紅蛋白逐漸變成不穩(wěn)定的部分水解的亞鐵肌紅蛋白，釋放出來的鐵形成非血紅素膠狀氫氧化鐵。由此推測，對于由金屬置換所導(dǎo)致的鋅-原卟啉Ⅸ形成而言，肌紅蛋白的水解和無機(jī)三價鐵沉淀是其必須條件。

2.7 鋅-原卟啉Ⅸ的形成機(jī)理預(yù)測模型

圖 4 鋅-原卟啉Ⅸ的形成機(jī)理預(yù)測模型[28]

Fig.4 Suggested mechanism of zinc protoporphyrin IX formation[28]

鋅-原卟啉Ⅸ被認(rèn)為是通過金屬轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)生的，肌紅蛋白中原卟啉環(huán)中的Fe（Ⅱ）被zinc（Ⅱ）所替代，但鋅-原卟啉Ⅸ的形成機(jī)理仍未解明，其可能的3個途徑為：1）非酶觸反應(yīng)：厭氧條件下Zn2+替代Fe2+，該過程受氧氣、亞硝酸鹽、一氧化氮及加熱等因素影響；2）內(nèi)源性亞鐵螯合酶觸反應(yīng)：該酶活性在成熟過程中逐漸減弱，而且不同肌肉組織中該酶活性不同；3）微生物酶觸反應(yīng)：引起包括血紅素在內(nèi)的肌肉蛋白水解，從而導(dǎo)致金屬離子置換[3-4，7]。其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由內(nèi)源性亞鐵螯合酶（Ferrochelatase）所引起的金屬離子置換反應(yīng)可產(chǎn)生具有高熒光性的鋅-原卟啉Ⅸ色素[24，27]。另外，鋅-原卟啉Ⅸ色素也可能由非酶促金屬化反應(yīng)引起，鋅（Ⅱ）自動可進(jìn)入原卟啉Ⅸ環(huán)中。在中性條件下游離鐵離子會自動氧化為三價鐵離子，當(dāng)有氨基酸和磷酸鹽等螯合劑的存在時，會在肌肉中成為膠體鐵（Ⅲ）（圖4）。這對于防止二價鐵把原卟啉Ⅸ環(huán)中的鋅（Ⅱ）置換出來至關(guān)重要。而且膠體鐵（Ⅲ）形成可消耗可溶性鐵離子（Ⅱ）/（Ⅲ），防止脂肪和蛋白質(zhì)氧化。

3 結(jié) 語

肉與肉制品的色澤是重要的品質(zhì)評價指標(biāo)，通常通過添加硝酸鹽或亞硝酸鹽以獲得誘人的肉制品色澤，但隨著我國居民對健康、美味、安全、方便的食品需求的不斷增長，無硝/低硝肉制品已成為肉品加工領(lǐng)域的研究重點(diǎn)方向之一。帕瑪火腿等干腌肉制品在不添加硝酸鹽/亞硝酸鹽的條件下可形成亮紅色的鋅-原卟啉Ⅸ色素，但其形成機(jī)制尚未闡明。今后，需進(jìn)一步研究肉制品中鋅-原卟啉Ⅸ的形成機(jī)制，為開發(fā)健康美味的低硝/無硝肉制品提供理論基礎(chǔ)。

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