湛劍龍

摘 要：從貴州侗族酸肉中篩選出一株乳酸菌，其DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、還原能力、抗脂質(zhì)過氧化能力分別為（59.67±6.68）%、（153.17±5.50）%、（47.31±4.62）%、（55.00±5.19）%，并且菌株有良好耐受NaCl和NaNO2的性能。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；抗氧化；特性

Abstract： A strain of lactic acid bacteria was selected from sour meat of the Dong ethnic minority in Guizhou， China. Its DPPH and hydroxyl radical scavenging activities， reducing power and anti-lipid peroxidation activity were （59.67 ± 6.68）%， （153.17 ± 5.50）%， （47.31 ± 4.62）% and （55.00 ± 5.19）%， respectively. Moreover， the strain had good tolerance to NaCl and NaNO2.

Key words： lactic acid bacteria； antioxidant activity； characteristics

中圖分類號(hào)：TS252.54 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2014）06-0001-04

乳酸菌的主要功能有降低膽固醇、抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤等[1-4]。其中抗氧化能力為一般保健品所具有的功能，能清除人體自由基、防止DNA損害、延緩衰老[5]。篩選抗氧化乳酸菌具有重要意義?？寡趸樗峋木N特性已經(jīng)有類似的研究[6-7]，深度發(fā)掘了乳酸菌的功能特性，對乳酸菌的生產(chǎn)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。但還是有一些局限性，如不同地區(qū)，地域的乳酸菌的性能是否一致，乳酸菌在抗氧化方面的能力是否都很強(qiáng)，主要由什么指標(biāo)體現(xiàn)。乳酸菌類型繁多，資源豐富，制作食物或發(fā)酵產(chǎn)品的材料和方法隨地區(qū)不同（各種地域環(huán)境中的自然菌群不同），當(dāng)?shù)仫L(fēng)俗習(xí)慣的不同而有很大差異，得到的乳酸菌也不同，結(jié)果也不一定相同[8-12]。本實(shí)驗(yàn)以一種貴州侗族酸肉為材料，篩選出一株乳酸菌，以DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、還原能力、抗脂質(zhì)過氧化能力為抗氧化能力篩選指標(biāo)，以期為抗氧化的乳酸菌的篩選提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸肉6號(hào)樣品（SR6）采自江縣餅妹鎮(zhèn)鑾里村，采樣時(shí)嚴(yán)格按照GB/T 4789.1—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》操作。

MRS肉湯培養(yǎng)基﹑PY培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基（PY培養(yǎng)基中添加10g/L葡萄糖） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；結(jié)晶紫 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；草酸銨 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；碘片 天津博迪化工股份有限公司；碘化鉀 天津市化學(xué)試劑供銷公司；無水

乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；過氧化氫 重慶

江川化工有限公司；甲基紅﹑1，10-菲咯啉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；α-萘酚 國藥集團(tuán)試劑有限公司；氫氧化鉀 東莞市東旺化玻儀器有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管（葡萄糖）﹑細(xì)菌微量生化鑒定管（麥芽糖）﹑細(xì)菌微量生化鑒定管（乳糖） 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；葡萄糖﹑氯化鈉﹑亞硝酸鈉﹑鐵氰化鉀﹑三氯化鐵﹑磷酸氫二鈉 成都金山化學(xué)試劑有限公司；乳糖 天津市大茂化學(xué)試劑廠；二苯代苦味肼基自由基 日本進(jìn)口原裝 TCI；硫酸亞鐵 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸﹑硫代巴比妥酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀 上海廣諾化學(xué)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；S1000TM Thermal Cycler PCR儀、Gel DocXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；Gilson P型移液器 法國吉爾森公司；Micro 17R微量高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Electron公司；

XW-80A渦旋混合器 江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化與保存

采用平板稀釋涂布法進(jìn)行菌落分離。取3 g樣品，接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。稀釋8個(gè)梯度（10-1～10-8）后涂布滅菌的MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，再采用平板劃線法依次接種于MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑出平板上生長較好的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，進(jìn)行鏡檢，觀察并記錄該菌株的形態(tài)大小和顏色。直到最終的鏡檢結(jié)果和上次的結(jié)果一致，并且沒有雜菌，可停止對該菌種的分離純化。將純化后的菌株―18 ℃保存于30%MRS液體培養(yǎng)基中備用。

1.3.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 甲基紅實(shí)驗(yàn)

接種SR6于5 mL PYG培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)48 h后加入甲基紅指示劑，如指示劑變紅，則為陽性，出現(xiàn)黃色則為陰性。

1.3.2.2 乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)（V-P實(shí)驗(yàn)）

接種SR6菌株于裝有5 mL PYG培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)48 h后在其中加入1.2 mL試劑A（a-萘酚純酒精溶液）和0.4 mL試劑B（40%KOH水溶液），并進(jìn)行振蕩，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或37 ℃恒溫箱，如2 h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。

1.3.2.3 淀粉水解實(shí)驗(yàn)

接種SR6于裝有2 mL PYG液體培養(yǎng)基的實(shí)管中，放入36 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，再加入2～3 滴碘液前進(jìn)行振蕩，滴加碘液后，若出現(xiàn)藍(lán)色，再進(jìn)行振蕩觀察藍(lán)色是否消失。通過現(xiàn)象觀察，可以判斷淀粉是否水解或完全水解。

1.3.2.4 過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)（觸酶實(shí)驗(yàn)）

直接滴加3%過氧化氫于裝有備有菌種的PYG培養(yǎng)基中，立即觀察，有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。

1.3.2.5 葡萄糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)

使用細(xì)菌微量生化鑒定管（葡萄糖）進(jìn)行測定。接種SR6菌株50 μL于安瓿瓶中，振蕩均勻，于37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察顏色變化。出現(xiàn)黃色則為陽性。

1.3.2.6 麥芽糖﹑乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

采用細(xì)菌微量生化鑒定管進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)方法與葡萄糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)相同。

1.3.3 DNA提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。

1.3.4 PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA全長[13]

1）采用細(xì)菌通用引物：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5- GGTTACCTTGTTACGACTT-3；2）25 μL反應(yīng)體系：1 μL模板DNA，引物（1 μmol/L）

各2.5 μL，Go Taq Green Master Mix（2×）12.5 μL，去離子水6.5 μL；3）反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；25個(gè)循環(huán)：94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；最終72 ℃延伸2 min。用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行測序分析，在ABI DNA自動(dòng)測序儀上進(jìn)行測序反應(yīng)。登陸NCBI網(wǎng)站，與已知基因序列進(jìn)行比對。

1.3.5 抗氧化能力的測定

1.3.5.1 菌懸液的制備

供實(shí)菌于MRS 培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液3500 r/min 離心10 min，收集菌體，并用PBS洗滌3 次，最后用PBS將乳酸菌的菌數(shù)調(diào)整到109 CFU /mL，即為待測菌體（IC）[6]。

1.3.5.2 抗氧化能力的測定

菌體清除DPPH自由基的能力實(shí)驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行；菌體清除羥自由基能力實(shí)驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行；菌株還原能力實(shí)驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行；菌株抗脂質(zhì)過氧化能力測定：參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

1.3.6 菌種特性研究

1.3.6.1 生長曲線的測定

接種后每2 h即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h用分光光度計(jì)于波長600 nm測吸光度，最后根據(jù)以生長時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.6.2 pH值的測定

SR6菌株直接接種于MRS培養(yǎng)基中，并放于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每2 h進(jìn)行pH值測定。

1.3.6.3 耐鹽性實(shí)驗(yàn)

SR6菌株分別接種于添加了0%、2%、4%和6% NaCl溶液的MRS培養(yǎng)基中，并放于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于波長600 nm測吸光度。

1.3.6.4 耐硝性實(shí)驗(yàn)

SR6菌株分別接種于添加0、50、100 mg/kg和150 mg/kg NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基。37℃ 培養(yǎng)24 h后，于 600 nm測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的菌落特征和菌體形態(tài)

編號(hào)：SR6；菌落特征：微透明，凸起，光滑圓整，直徑（1±0.3）mm；鏡檢菌體形態(tài)：G+，無芽孢，鏈狀，桿菌。

2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從貴州省侗族酸肉樣品中篩選得到一株彎曲乳桿菌LAB26（Lactobacillus curvatus strain LAB26）。具有較強(qiáng)抗氧化能力：其DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、還原能力、抗脂質(zhì)過氧化能力分別為（59.67±6.68）%、（153.17±5.50）%、（47.31±4.62）%、（55.00±5.19）%。SR6生長周期較短，調(diào)整期0～2 h、對數(shù)期2～14 h、穩(wěn)定期14～20 h、20 h以后進(jìn)入衰亡期。SR6在含6%NaCl的MRS培養(yǎng)基中生長狀況依然良好，并且對NaNO2有很好的耐受力。

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