沈雁等

摘 要 研究吲哚丁酸的體外抗氧化活性，包括DPPH自由基、羥基自由基和過(guò)氧化氫的清除能力，以及金屬螯合活性和還原力。結(jié)果表明，吲哚丁酸具有顯著的抗氧化活性，且與吲哚乙酸相當(dāng)，其對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除作用、螯合力、還原能力均高于萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸，而對(duì)Fe2+的絡(luò)合能力與沒食子酸無(wú)顯著差異。

關(guān)鍵詞 吲哚丁酸；抗氧化；自由基

中圖分類號(hào) Q946；Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Antioxidant Activity of Indole-3-butyric Acid

SHEN Yan1， 2， CHEN Weijun4， ZHANG Tao3 ， JIANG Xuefei1， 2

LI Xinguo1， 2 *， LI Shaopeng1， 2， SONG Xiqiang1， 2

1 Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of

Education， Haikou， Hainan 570228， China

2 College of Horticulture and Landscape， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Food Science and Technique， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

4 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract The antioxidant activity of indole-3-butyric acid was studied by measuring the DPPH scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity， hydrogen peroxide scavenging activity， metal chelating activity and reducing power. The results showed that both IBA and IAA expressed a stronger antioxidant activity than NAA and 2，4-D in the DPPH scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity， metal chelating activity， reducing power. Compared with GA， no significant difference in metal chelating activity was appeared.

Key words Indole-3-butyric acid； Antioxidant； Free radical

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.019

吲哚（Indole）是吡咯和苯并聯(lián)的化合物，分子內(nèi)含有亞胺基，許多具有抗癌[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]藥理功能的物質(zhì)都來(lái)源于吲哚類衍生物，通常由吲哚環(huán)作為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)合成。近年來(lái)，吲哚類衍生物的生理活性和其活性機(jī)理被大量地研究和開發(fā)[4]，其中最受青睞的就是這類物質(zhì)的抗氧化作用。吲哚類衍生物可以通過(guò)清除自由基從而阻止糖類和脂質(zhì)發(fā)生氧化，其清除能力主要是由吲哚環(huán)上的氮原子提供，被稱作是吲哚類衍生物的“活性還原中心”[5-7]。

吲哚丁酸（Indole-3-butyric acid，IBA）作為一類含有吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)的植物激素，能夠抑制根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)側(cè)根原基的發(fā)生，在根的頂端優(yōu)勢(shì)的調(diào)控中起著十分重要的作用[8-10]；但是目前對(duì)其促進(jìn)生根的機(jī)理研究仍不明確。由于吲哚類衍生物本身具有的潛在的抗氧化作用，因此，吲哚丁酸可能是通過(guò)其抗氧化作用調(diào)控植物體內(nèi)的氧化還原平衡，從而達(dá)到對(duì)植物體氧化脅迫的保護(hù)作用。為了驗(yàn)證這一猜測(cè)，筆者研究了IBA體外對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、過(guò)氧化氫的清除能力，以及對(duì)二價(jià)鐵離子的絡(luò)合能力，并同其他的激素做了比較，以期為后續(xù)的研究提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 UV-1200紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SL-N型分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；PYX-DHG-9101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海康儀有限公司）；CQ-10超聲波清洗器（寧波海矚五方超聲設(shè)備有限公司）；Heraeus Multifuge XIR高速離心機(jī)（Thermo scientific）。

1.1.2 主要試劑 2-脫氧核糖、抗壞血酸、DPPH、Ferrozine鐵試劑、硫代巴比妥酸、鐵氰化鉀皆購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司；其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 DPPH自由基清除試驗(yàn) 依據(jù)Blois方法測(cè)定DPPH自由基清除能力[11]。將2 mL 4 mmol/L的不同樣品溶液加入到2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中。置于避光條件下反應(yīng)30 min后，測(cè)定各混合溶液在517 nm處的光吸收值，較低的吸收值意味著高效的DPPH自由基清除能力。

DPPH自由基的清除率=（1-A樣品/A模型）×100%

1.2.2 還原能力的測(cè)定 根據(jù)Oyaizur的方法[12]，并進(jìn)行改進(jìn)。移取1 mL 1 mmol/L的各樣品溶液于試管中，加入2.5 mL 0.2 mol/L，pH6.6的磷酸緩沖液和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合后于50 ℃水浴20 min后，再加入10%三氯乙酸1 mL，3 500 r/min常溫離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻后在700 nm處比色。

1.2.3 羥基自由基的清除試驗(yàn) 根據(jù)Elizabeth方法[13]，略加改進(jìn)。在225 μL 0.1 mmol/L，pH7.4磷酸緩沖液中加入10 mmol/L脫氧核糖溶液125 μL，10 mmol/L過(guò)氧化氫溶液50 μL，25 μL 10 mmol/L的三氯化鐵溶液，10 mmol/L EDTA溶液25 μL和4 mmol/L的樣品溶液0.1 mL。通過(guò)添加0.03 mL 10 mmol/L的抗壞血酸引發(fā)反應(yīng)，37 ℃水浴1 h，加入1%硫代巴比妥酸0.25 mL和2.8%三氯乙酸0.25 mL。90 ℃下水浴15 min，冷卻后在532 nm處測(cè)光吸收值。

羥基自由基的清除率=（1-A樣品/A模型）×100%

1.2.4 清除過(guò)氧化氫能力試驗(yàn) 根據(jù)Wettasinghe方法[14]。用磷酸緩沖液（pH7.4）配制43 mmol/L的過(guò)氧化氫溶液。使其在230 nm處的摩爾吸收系數(shù)為81 mol/（L·cm）。取1 mL 1 mmol/L不同樣品溶液加入到2 mL過(guò)氧化氫溶液中。反應(yīng)10 min后測(cè)定其在230 nm的光吸收值，以不含過(guò)氧化氫溶液的試樣作為對(duì)照組。

1.2.5 Fe2+絡(luò)合能力測(cè)定 參考Yen Gow-Chin方法[15]。移取2 mL 0.4 mmol/L樣品于試管中，加入1 mmol/L FeSO4溶液0.4 mL和5 mmol/L的Ferrozine鐵試劑溶液0.8 mL，室溫下反應(yīng)10 min后，再加入1 mL無(wú)水乙醇。在562 nm處測(cè)吸光率。

Fe2+絡(luò)合率=（1-A樣品-A模型）×100%

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS20軟件處理，差異顯著性水平為α=0.05，多重比較使用單因素方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除作用

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在517 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，通過(guò)此波長(zhǎng)下吸光值的減少可表征抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除能力[16]。由圖1可知，5種樣品清除DPPH自由基的活性，其中GA、IAA和IBA表現(xiàn)出顯著清除DPPH自由基的能力，清除率分別為95.51%、45.42%和28.67%。雖然IAA和IBA的DPPH自由基清除活性均顯著低于GA，但均顯著高于2，4-D（6.34%）和NAA（8.43%），同時(shí)2，4-D和NAA兩者對(duì)DPPH的清除率之間差異不明顯（p>0.05）。

2.2 還原力的測(cè)定

還原力的大小是評(píng)判分子抗氧化能力的主要指標(biāo)之一。圖2顯示的5個(gè)樣品的還原能力，較高的吸光度顯示較強(qiáng)的還原能力。GA和IBA、NAA的乙醇溶液測(cè)定有較高的還原力，它們之間表現(xiàn)出顯著的差異（p<0.01）。IBA吸光值為0.280，還原能力居中，與IAA無(wú)顯著差異。

2.3 測(cè)定羥基自由基的清除作用

通過(guò)抑制脫氧核糖降解測(cè)定樣品對(duì)羥基自由基的清除活性，過(guò)氧化氫和Fe2+反應(yīng)形成羥基自由基，隨后攻擊脫氧核糖導(dǎo)致其降解為一系列片段脫氧核糖。一些或所有的脫氧核糖片段，在較低的pH值下與硫代巴比妥酸反應(yīng)形成粉紅色的物質(zhì)。從圖3可知，IBA的清除率為91.33%，是幾個(gè)樣品中羥基自由基的清除活性最高值，其次是IAA，二者間差異并不顯著。GA的清除率最低。

2.4 過(guò)氧化氫的清除作用

過(guò)氧化氫具有穿透生物膜的能力，同時(shí)在其他自由基形成過(guò)程中作為一個(gè)中介生產(chǎn)更多的活性氧分子。從圖4可以看出，IBA具有很強(qiáng)的清除過(guò)氧化氫的能力，清除率高達(dá)93.29%，其次是GA和IAA，NAA的清除能力則最小。

2.5 金屬Fe2+絡(luò)合活性的測(cè)定

金屬離子在自由基產(chǎn)生過(guò)程中起著重要作用，抗氧化劑通過(guò)絡(luò)合金屬離子而減少活性氧自由基的產(chǎn)生。從圖5可以看出，5種物質(zhì)的金屬絡(luò)合活性不強(qiáng)，其中NAA和2，4-D基本沒有絡(luò)合活性，對(duì)Fe2+的絡(luò)合率分別為2.18%和2.51%。而IAA、IBA和GA雖然表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的絡(luò)合作用，但是仍低于10%；此外IBA（8.21%）和GA（8.37%）之間無(wú)顯著差異性（p>0.05）。

3 討論與結(jié)論

筆者采用不同的自由基體系研究了IBA分子本身的抗氧化能力。天然產(chǎn)物抗氧化分子機(jī)理主要有H轉(zhuǎn)移機(jī)制[17-18]、電子轉(zhuǎn)移機(jī)制[19-21]和金屬絡(luò)合機(jī)制[22-23]。本研究對(duì)于DPPH自由基、羥基自由基、過(guò)氧化氫的清除活性評(píng)價(jià)主要是從H轉(zhuǎn)移機(jī)制方面考慮，還原力和絡(luò)合能力則分別是從電子轉(zhuǎn)移機(jī)制和金屬絡(luò)合機(jī)制方面研究IBA可能具有的抗氧化活性。從以上結(jié)果可以看出，在活性氧清除方面，IBA對(duì)于DPPH自由基、羥基自由基、過(guò)氧化物的清除能力較為突出，明顯高于NAA和2，4-D。IAA在DPPH自由基和過(guò)氧化氫清除能力方面略高于IBA，這主要是由于其分子中的烷基鏈影響的結(jié)果。眾多的研究證明烷基鏈的長(zhǎng)短對(duì)其分子的抗氧化有較大影響，主要原因是通過(guò)改善分子的電子布局和疏水性實(shí)現(xiàn)的[24]。對(duì)還原力和金屬絡(luò)合作用的研究發(fā)現(xiàn)IBA和IAA活性間差異不顯著，這也說(shuō)明其烷基鏈對(duì)它們的影響不明顯。

GA的抗氧化活性已被系統(tǒng)研究[25]，它常用來(lái)做評(píng)價(jià)其他天然產(chǎn)物活性大小的標(biāo)準(zhǔn)品之一[26-28]。本研究的結(jié)果可以看出，在活性氧清除和絡(luò)合能力方面，IBA的能力均略高或接近于GA，而在還原力方面低于GA。GA的抗氧化機(jī)制已經(jīng)確認(rèn)為其分子中的羥基進(jìn)行H轉(zhuǎn)移所致[29]。由此可以判斷，IBA的抗氧化活性機(jī)制與H轉(zhuǎn)移和絡(luò)合有關(guān)。酸類抗氧化劑的金屬絡(luò)合主要和它的臨位羥基和羰基有關(guān)[30]，因此可以推測(cè)IBA對(duì)金屬的絡(luò)合主要是通過(guò)羰基實(shí)現(xiàn)的，但關(guān)于IBA的H轉(zhuǎn)移發(fā)生的具體位點(diǎn)目前還不清楚，一般認(rèn)為可能會(huì)來(lái)源于與-NH中的H，也有可能來(lái)自-COOH的氫，具體的發(fā)生位點(diǎn)尚需下一步的研究。

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