摘 要 鯊烯合酶（SQS）是枇杷三萜酸生物合成過程中的關(guān)鍵酶。以枇杷（Eriobotrya japonica L.）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，采用RT-PCR和RACE方法分離得到枇杷鯊烯合酶Ej-SQS（Squalene synthase）基因的cDNA全長序列（GenBank，JQ294055），共1 775 bp，包含了5′非編碼區(qū)為97 bp，開放閱讀框為1 239 bp，3′非編碼區(qū)為439 bp。該cDNA的開放閱讀框推定的氨基酸序列（含412個氨基酸）與其它植物SQS具有79%～94%同源性，包含Trans_IPPS_HH保守結(jié)構(gòu)域，可能屬于Isoprenoid Biosynthesis enzymes，Class 1家族。為今后利用基因工程調(diào)控枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物以提取目標(biāo)產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 枇杷；鯊烯合酶基因；基因克隆；序列分析

中圖分類號 S667.2 文獻標(biāo)識碼 A

Cloning and Sequence Analysis of Squalene Synthase

Gene in Eriobotrya japonica L.

LI Huihua，LIU Xiaoying，WANG Wei，CHANG Qiang，SU Minghua*

Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China

Abstract The cDNA of SQS（Squalene Synthase Gene）， which was an importent enzyme of terpenes synthesis， was cloned with RT-PCR and RACE from cell suspension culture of Eriobotrya japonica L. The full length of Ej-SQS cDNA（GenBank， JQ294055）， about 1 775 bp， consisted of an open reading frame of 1 239 bp， and 5′ and 3′ un-translated regions of 97 bp and 439 bp respectively. The putative protein had 412 amino acids， and the identity to the other polypeptides varied between 79%～94%， contained Trans_IPPS_HH conserved domains， and belonged to isoprenoid biosynthesis enzymes， class 1 family. It was the foundation of the further regulation of loquat cell suspension cultures to extract the desired product， using genetic engineering.

Key words Eriobotrya japonica L.； Squalene synthase gene； Gene cloning； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.009

枇杷（Eriobotrya japonica L.）屬薔薇科（Rosaceae）枇杷屬，是原產(chǎn)中國東南部的一種重要的小喬木，果實在秋冬開花，春夏成熟，被稱是“果木中獨備四時之氣者”，除此之外，葉、果、花都是傳統(tǒng)的中藥，枇杷中三萜酸類成分具有抗炎、降血糖、抗病毒以及抗癌的活性，其中熊果酸（Ursolic Acid，UA）、齊墩果酸、科羅索酸為主要的藥用成分，市場十分緊缺，經(jīng)濟價值高[1-4]。

目前對此類化合物的生物合成途徑已有一定的了解。整個代謝途徑涉及眾多酶促反應(yīng)，其中鯊烯是三萜類、甾醇類、膽固醇類等烯萜類的共同前體，鯊烯合酶（SQS，Squalene synthase，EC2.5.1.21）是生物體中催化類異戊烯代謝途徑向甾醇和三萜生物合成轉(zhuǎn)化的第一個關(guān)鍵酶，其催化2分子的法尼基焦磷酸（FPP）尾尾縮合，形成鯊烯（SQ）[5-8]。

在甘草[9]、三七[10]、人參[11-12]等藥用植物上已克隆到SQS cDNA全長序列，但枇杷上還沒有SQS克隆的相關(guān)報道。利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是目前中藥生產(chǎn)中極具潛力的技術(shù)路線[13-16]。本研究基于正在進行的枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物UA含量的試驗，克隆枇杷三萜酸合成途徑中的關(guān)鍵酶SQS基因的cDNA全長序列，為今后利用基因工程調(diào)控枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物以提取目標(biāo)產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用枇杷（Eriobotrya japonica L.）品種早鐘6號，其幼胚中誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)過多次繼代后轉(zhuǎn)液體培養(yǎng)，經(jīng)人工調(diào)控后建立懸浮細(xì)胞系，以此為試驗材料，由福建省亞熱帶植物研究所（廈門）細(xì)胞培養(yǎng)實驗室保存，具體建立方法參見李惠華等[17]。試驗于2011～2012年開展完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用北京天恩澤公司的柱式植物RNAOUT 2.0參考試劑盒，按照說明書提取枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物總RNA；采用Fermentas公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，以O(shè)ligo（dT）18為引物參照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 引物設(shè)計 檢索數(shù)據(jù)庫中已有序列，設(shè)計保守區(qū)引物；繼而參考保守區(qū)測序結(jié)果及其它物種的序列設(shè)計3′ RACE以及5′ RACE巢式PCR反應(yīng)的基因特異性引物；經(jīng)3次擴增測序拼接后獲得cDNA全長序列，據(jù)此設(shè)計用于擴增SQS的ORF（開放閱讀框）序列的引物。PCR反應(yīng)中涉及的引物序列見表1。

1.2.3 PCR擴增 反應(yīng)體系（試劑購自TaKaRa 公司）：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTPs Mix（2.5 mmol/L）2 μL，cDNA 2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，0.2 μL Ex Taq （5 U/μL），H2O 16.3 μL，總體積為25 μL。程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 1 min、TM ℃（退火溫度）1 min、72 ℃ t s（延伸時間），35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR擴增。引物、TM、t具體值見表2。

3′RACE以AP為逆轉(zhuǎn)錄引物，其它同方法1.2.1。5′RACE參照TaKaRa公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit的試劑盒說明書，以NUP-long為逆轉(zhuǎn)錄引物。巢式PCR第一輪產(chǎn)物做10-100倍稀釋作第二輪擴增的模板。

1.2.4 TA克隆及測序 回收目的片段（Solarbio公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒），以pGEM-T（PROMEGA公司）為載體進行T/A克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑陽性克隆子測序，引物合成及測序均委托華大基因公司。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 目的基因引物設(shè)計、序列拼接及分析采用DNAMAN軟件，cDNA核酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列采用ExPASy ProtParam、NCBI-CDS、PSORT、TMHMM2.0、SignalP、Jpred、Coils、NetPhos 2.0、Gene Ontology annotation等在線軟件進行分析，具體參考李惠華等文獻中方法[17]；系統(tǒng)進化樹建立使用MEGA 5.0軟件（Neighbor-Joining，NJ方法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷懸浮培養(yǎng)細(xì)胞總RNA的質(zhì)量

采用1.2.1中試劑盒方法提取的枇杷懸浮培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，總耗時為1 h，紫外分光測定總RNA的A260/A280為2.012，經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測為完整清晰的3條帶（圖1-A-1），并且28 S條帶亮度約為18 S條帶2倍，表明此方法提取的枇杷懸浮培養(yǎng)細(xì)胞總RNA的質(zhì)量高，可以用于后續(xù)試驗。

2.2 枇杷SQS基因的cDNA全長序列的克隆

方法1.2.1中逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板，PCR擴增得到一條約830 bp的DNA片段，測序表明此片段長度為824 bp（圖1-B-2），經(jīng)GenBank上blastn和blastp表明，與蘋果SQS的核酸及氨基酸序列（GenBank登錄號KC895979，AGS78117）分別有97%及95%同源，初步推斷此片段為枇杷SQS的cDNA部分序列。

以3′RACE逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用基因特異性引物P3和P4進行巢式PCR，瓊脂糖（1%）電泳顯示：1條約1 000 bp單一條帶（圖1-C-3），與預(yù)期相符，測序后確認(rèn)此片段大小為1 052 bp，與保守區(qū)序列比對有44 bp的重疊片段，表明此片段是枇杷SQS的cDNA的3′末端。

以5′RACE逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用基因特異性引物P5和P6進行巢式PCR，電泳顯示：長度約450 bp的單一條帶（圖1-D-4），測序后確認(rèn)此片段大小為394 bp，與保守區(qū)序列比對有157 bp的重疊片段，表明此片段是枇杷胚性愈傷組織SQS的cDNA 5′端序列。

基于保守區(qū)、3′RACE和5′RACE擴增測序結(jié)果，拼接得到的枇杷SQS的cDNA全長序列，采用引物P7和P8（表2）進行了ORF的擴增，電泳表明獲得長度約1.2 kb 1條清晰的DNA條帶（圖1-E-5），克隆測序后確定此片段為1 239 bp，包含1個完整的編碼框，與拼接的cDNA全長序列的相應(yīng)部分（軟件預(yù)測的ORF）重疊，與拼接序列相互印證。

2.3 枇杷SQS基因的序列分析

枇杷愈傷組織SQS的cDNA序列，命名為Ej-SQS（GenBank登錄號為JQ294055），全長為1 775 bp，5′末端非編碼區(qū)為97 bp，3′末端非編碼區(qū)為439 bp，3′poly（A）尾長14 bp，開放閱讀框為1 239 bp。

2.4 枇杷SQS的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析表明：Ej-SQS編碼412個氨基酸（其中帶負(fù)電的氨基酸占50.51%，帶正電的氨基酸占49.49%），分子量為46.9 ku，pI 6.80，屬親水蛋白；此蛋白包含Trans_IPPS_HH保守結(jié)構(gòu)域，可能屬Isoprenoid Biosynthesis enzymes，Class 1家族成員；亞細(xì)胞定位在質(zhì)膜中的可能性最大；在第281～303位氨基酸，由外到內(nèi)，以及第386～408位，方向是由內(nèi)到外，共有2個跨膜螺旋；該蛋白不是分泌蛋白，無信號肽；其主要的二級結(jié)構(gòu)是α螺旋；形成卷曲螺旋的可能性低；其磷酸化位點有33個，在整條多肽鏈中分布非均勻。其功能為：參與脂質(zhì)生物合成，為膜的組分，具有法尼基二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶活性及鯊烯合酶活性。

Ej-SQS的cDNA核酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列（Eriobotrya japonica，GenBank AFI33135.3，薔薇科）與百脈根（Lotus japonicus，GenBank BAC56854.1，豆科），黃芪（Astragalus membranaceus，GenBank ADW27427，豆科），大豆（Glycine max，GenBank NP 001236365，豆科），光果甘草（Glycyrrhiza glabra，GenBank BAA13084，豆科），大戟（Euphorbia pekinensis，GenBank AFT92039，大戟科），遠志（Polygala tenuifolia，GenBank ABG66304，遠志科），蘋果（Malus domestica，GenBank AGS78118，薔薇科），油茶（Camellia oleifera，GenBank AGB0560，茶科），青蒿（Artemisia annua，GenBank AAR20329.1，菊科），人參（Panax ginseng，GenBank ACV88718，五加科），紫胡（Bupleurum chinense，GenBank ACX42423.1，傘形科），刺五加（Eleutherococcus senticosus，GenBank AER23670.1，五加科）的氨基酸序列的同源性分別為81%、81%、85%、83%、80%、79%、94%、83%、79%、83%、79%、82%。共13條氨基酸序列構(gòu)建成的系統(tǒng)進化樹（圖2），枇杷與同為薔薇科的蘋果首先聚類，同為豆科的百脈根、黃芪、大豆、光果甘草，同為五加科的人參、刺五加也處于進化樹的同一個分枝或鄰枝，其有著很近的進化距離，與油茶、紫胡等有著相對較近的進化關(guān)系。同時可以看出SQS基因在各物種中是很保守的。

3 討論與結(jié)論

3.1 枇杷懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在分子生物學(xué)試驗中的優(yōu)越性

一般來說，木本植物的RNA提取較草本植物難，枇杷材料通常采用傳統(tǒng)SDS或CTAB法提取RNA[18]。用于RT-PCR及RACE的RNA應(yīng)完整無降解，否則會導(dǎo)致PCR擴增特別是5′RACE的失敗。本試驗采用的是枇杷幼胚中誘導(dǎo)的愈傷組織建立的懸浮系的細(xì)胞培養(yǎng)物作為試驗材料，因其可能少含或不含脂類、樹脂類、葉綠素等成分，在核酸提取上更加簡便、快捷，可以采用市面上普通的RNA快速提取試劑盒，且提取的總RNA質(zhì)量高，可以直接用于后續(xù)試驗。在分子生物學(xué)試驗操作中，枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物較其它材料有程序簡化、快速、得率高的優(yōu)點。這與龍眼中結(jié)果相似。以龍眼胚性愈傷組織或栽培品種龍眼為基因克隆材料得到的ACO基因的編碼序列完全一致[19]。至于枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物為材料克隆得到的基因與栽培的枇杷序列是否有不同，是否是枇杷目的基因分離的替代體系，需要進一步試驗。

3.2 RT-PCR結(jié)合RACE的同源克隆方法較適合于枇杷SQS基因

SQS基因的克隆主要采用：①功能互補；②RT-PCR與RACE 相結(jié)合；③RT-PCR與篩庫相結(jié)合。已報道的各植物之間SQS的序列同源性較高[20]，這為進行同源克隆提供了有利條件。通過試驗，結(jié)果表明枇杷SQS序列與其它植物SQS具有79%～94%同源性，再次證明植物之間氨基酸序列的相似性很高。在本試驗中，枇杷SQS基因的保守區(qū)、3′序列和5′序列均一次獲得，目的條帶均單一清晰明亮。SQS基因的同源克隆總體較為順利，這可能與SQS的高度保守性有關(guān)，也可能與在枇杷懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的高豐度的表達有關(guān)。今后其它植物中SQS基因的克隆可以首先考慮RT-PCR與RACE相結(jié)合的方法。

3.3 今后枇杷SQS基因的若干研究方向

SQS在多種植物中超表達能夠明顯提高植物甾醇和三萜類物質(zhì)的含量。例如：人參中鯊烯合成酶的過量表達可以提高其藥用成份三萜皂苷的含量[21]。蔣世翠[22]研究也發(fā)現(xiàn)西洋參中SQS和SQE基因的表達具組織特異性，并且基因的表達量與人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd以及總皂苷的含量之間呈現(xiàn)出正相關(guān)。靈芝中靈芝三萜的產(chǎn)量多少與鯊烯合酶基因的表達以及酶活性密切相關(guān)，變化相符[23]。

本試驗克隆分離枇杷三萜類化合物的合成途徑中的關(guān)鍵酶SQS基因的cDNA序列，今后在此基礎(chǔ)上可以研究SQS基因的表達情況與三萜類化合物合成的相互關(guān)系，開展SQS基因功能研究，為今后通過人工調(diào)控枇杷細(xì)胞工程規(guī)?；a(chǎn)枇杷五環(huán)三萜化合物奠定基礎(chǔ)，同時也為枇杷基因改良提供基因源。

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責(zé)任編輯：葉慶亮