朱家紅等

摘 要 根據(jù)先前獲得的EST序列，從橡膠樹中克隆了1個(gè)編碼泛素結(jié)合酶的基因HbUBC5。HbUBC5 cDNA長度為567 bp，編碼185個(gè)氨基酸；HbUBC5在基因組中序列長度為2 441 bp，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。HbUBC5編碼蛋白具有典型的植物泛素結(jié)合酶E2的結(jié)構(gòu)特征，包含1個(gè)保守的UBC結(jié)構(gòu)域和1個(gè)高度保守的半胱氨酸活性位點(diǎn)，和其他植物中的E2蛋白具有很高的同源性。對HbUBC5啟動子區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)含有眾多應(yīng)答激素和脅迫信號元件。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明，HbUBC5在樹皮的表達(dá)量最高，在花中的表達(dá)量次之，在膠乳和葉片中的表達(dá)量相對較低；乙烯誘導(dǎo)能顯著上調(diào)基因的表達(dá)。研究結(jié)果表明，HbUBC5能對乙烯做出響應(yīng)，推測其可能參與了乙烯利刺激橡膠樹產(chǎn)生副作用的過程。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；泛素結(jié)合酶；基因表達(dá)；乙烯利

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Based on EST sequence previously obtained， a gene named HbUBC5 from rubber tree coding ubiquitin conjugating enzyme was cloned. Sequence analysis revealed that HbUBC5 cDNA leght was 567 bp， encoding 185 amino acids and DNA length was 2 441 bp， containing six exons and five introns. HbUBC5 protein shared high identities to ubiquitin conjugating enzymes from other plants， had the typical structure of plant ubiquitin conjugating enzyme， containing a conserved UBC domain and a highly conserved cysteine active site. several regulatory elements related to hormone and stress responses were found in the putative promoter region of HbUBC5. The real-time RT-PCR results indicated the highest expression of HbUBC5 was found in bark， followed by flower， latex and leaf； HbUBC5 was also induced significantly by ethephon. The above results suggest that HbUBC5 can respond to ethylene and may be involved in the process of adverse effects caused by ethephon stimulation on rubber trees

Key words Hevea brasiliensis； Ubiquitin conjugating enzyme； Gene expression； Ethephon

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.009

泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway，UPP）廣泛存在真核生物中，能夠通過選擇性降解細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中受損、異常和短命蛋白，在維持正常細(xì)胞功能及細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)、抵御環(huán)境脅迫、激素響應(yīng)和衰老等方面發(fā)揮著重要的作用[1-5]。泛素分子主要通過泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，UBC/E2）和泛素蛋白連接酶（ubiquitin protein ligase，E3）的次第作用連接到目標(biāo)蛋白上，目標(biāo)蛋白泛素化后被26S蛋白酶體所識別和降解[1，3]。泛素結(jié)合酶是泛素蛋白酶體途徑的重要組成部分，負(fù)責(zé)連接活化的泛素分子并將其移到泛素蛋白連接酶E3上，對泛素化修飾的特異性和精確時(shí)空性起關(guān)鍵作用[6-7]。植物體內(nèi)的泛素結(jié)合酶廣泛參與植物的生長發(fā)育及對生物和非生物脅迫的響應(yīng)，如DNA修復(fù)、光周期調(diào)控、維管發(fā)育、缺素脅迫響應(yīng)以及熱激、重金屬、干旱和病害等抗逆脅迫[8-12]。

真核生物泛素結(jié)合酶是多基因家族編碼蛋白，酵母中有11個(gè)E2s、人基因組中有50個(gè)E2s，擬南芥基因組中有37個(gè)E2s[13-14]，目前在NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的橡膠樹泛素結(jié)合蛋白酶基因有6個(gè)，但缺少相關(guān)基因分子特性及功能方面的研究。在先前構(gòu)建的乙烯利誘導(dǎo)的SSH文庫中，篩選獲得1個(gè)編碼泛素結(jié)合蛋白酶的EST序列。本研究在此基礎(chǔ)上對該基因編碼區(qū)cDNA序列和基因組序列進(jìn)行了克隆，對基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和表達(dá)特征等進(jìn)行分析，為深入研究其在橡膠樹中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）熱研 7-33-97來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場。選取6年生的橡膠樹，用1%乙烯利進(jìn)行誘導(dǎo)，處理方法參考Hao和Wu[15]的方法進(jìn)行，采集處理后0、3、6、12、24、48 h的膠乳迅速置于液氮中冷凍，-70 ℃保存，同時(shí)采集橡膠樹樹皮、樹葉和花等不同組織于液氮中迅速碾磨成粉末，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 核酸提取和cDNA合成 橡膠樹膠乳總RNA提取參考張治禮等[16]的方法；其他組織RNA提取參照Kiefer等[17]的方法；葉片DNA提取參考安澤偉等[18]的方法；cDNA第一條鏈合成采用北京全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體步驟參見說明書進(jìn)行。

1.2.2 HbUBC5基因和啟動子區(qū)的克隆 先前獲得的與其他植物泛素結(jié)合蛋白酶基因同源性較高的的No. 90 EST序列長度為443 bp，以該序列為探針在NCBI WGS數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，將搜素結(jié)果進(jìn)行分析和拼接，獲得基因的編碼區(qū)DNA序列和大約1 500 bp的啟動區(qū)序列。根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物HbUBCF（5′-GTAATCATGGACATGAGGCCA

AA-3′）和HbUBCR（5′-GATCAGCTCCTAAATAATTA

TCC-3′）對HbUBC5全長cDNA序列和DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增；引物PHbUBCF（5′-CTCTTCTATACAAGTC

TCTCTCTTG-3′）和PHbUBCR（5′-TTTGGCCTCATGT

CCATGATTAC-3′）對HbUBC5啟動子區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收和純化后，與T載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR檢測確定陽性克隆，送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 用ORF finder分析cDNA序列的開放閱讀框；利用在線軟件GSDS對基因的外顯子/內(nèi)含子進(jìn)行界定；蛋白質(zhì)序列分析在http：//www.expasy.org網(wǎng)站相關(guān)軟件完成；用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列的比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建；利用啟動子順式作用元件預(yù)測網(wǎng)站PLACE軟件對HbUBC5啟動子序列進(jìn)行分析。

1.2.4 HbUBC5表達(dá)分析 提取不同樣品的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以18S rRNA作為內(nèi)參采用康為世紀(jì)公司的SYBR Green RT-PCR One Step Kit及 Mx3005P PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測。 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的HbUBC5引物為QUBCF（5′-ATCTAGGTG

TGTCAGCATTTCC-3′） 和QUBCR（5′-CCCTCATACA

CAGTTCCCTTTC-3′）；內(nèi)參引物為Q18SF（5′-GCTC

GAAGACGATCAGATACC-3′）和Q18SR（5′-TTCAGC

CTTGCGACCATAC-3′）。具體反應(yīng)體系為：模板 0.5 μL，上下游引物混合物1 μL，2×SYBR Premix 10 μL，用水補(bǔ)足20 μL；PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；按默認(rèn)程序繪制55 ℃至 95 ℃融解曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbUBC5的克隆與序列分析

利用特異性引物對HbUBC5的cDNA和基因組 DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期目標(biāo)大小相符的片段（圖1）。目的片段經(jīng)回收、純化后進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明HbUBC5 cDNA長度為567 bp，包含1個(gè)558 bp的完整開放閱讀框，編碼185個(gè)氨基酸，編碼蛋白的分子量20.91 ku，理論等電點(diǎn)7.60。HbUBC5在基因組中序列長度為2 441 bp，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子（圖2），外顯子和內(nèi)含子的剪接均符合GT-AG原則。

推導(dǎo)的HbUBC5蛋白具有典型的植物泛素結(jié)合酶E2的結(jié)構(gòu)特征，包含1個(gè)保守的UBC結(jié)構(gòu)域（劃線處）和1個(gè)高度保守的半胱氨酸（cysteine）酶活性位點(diǎn)（圖3），與蓖麻（Ricinus communis）、黃瓜（Cucumis sativus）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）和大豆（Glycine max）中相應(yīng)的泛素結(jié)合酶蛋白的同源性分別為82%、76%、74%和73%，而與橡膠樹中已有的泛素結(jié)合酶HbUBC1、HbUBC2a、HbUB2b、HbUBC3、HbUBC4和HbE2的同源性分別只有19%、30%、30%、32%、24%和18%。

2.2 HbUBC5的進(jìn)化分析

根據(jù)E2蛋白的結(jié)構(gòu)特征，擬南芥37個(gè)E2成員分為12個(gè)亞族[13]。將 HbUBC5與擬南芥不同亞族E2蛋白及橡膠樹中已報(bào)道6個(gè)E2蛋白進(jìn)行序列比對，構(gòu)建同源進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，HbUBC5與Ⅷ亞族的AtUBC19和AtUBC2處在一個(gè)分支上，而HbUBC2a和HbUBC2b與Ⅲ亞族成員聚為一類；HbUBC1和HbE2與Ⅹ亞族成員聚為一類；HbUBC3與XV亞族成員聚為一類；HbUBC4與Ⅸ亞族成員聚為一類；表明HbUBC5與橡膠樹中其他E2成員的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

2.3 HbUBC5啟動子序列分析

通過PCR擴(kuò)增獲得了HbUBC5基因翻譯起始密碼子ATG上游1 482 bp的啟動子區(qū)（圖5），預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)該序列具有真核生物典型啟動子結(jié)構(gòu)特征，核心啟動子區(qū)位于ATG上游-267～-218 bp，其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)上游 -227 bp處。除了TATA-box和CAAT-box基本元件外，HbUBC5啟動子區(qū)還含有眾多應(yīng)答激素和脅迫信號元件，如2個(gè)乙烯應(yīng)答元件ERE、1個(gè)水楊酸應(yīng)答元件TCA-element、1個(gè)赤霉素應(yīng)答元件TATC-box、3個(gè)熱誘導(dǎo)應(yīng)答順式元件HSE、1個(gè)厭氧應(yīng)答元件ARE、1個(gè)防御和脅迫應(yīng)答元件TC-rich repeats和2個(gè)干旱應(yīng)答相關(guān)元件MBS等（圖6）。

2.4 HbUBC5的表達(dá)特征

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了HbUBC5在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示HbUBC5在所檢測的組織中均有表達(dá)，但有所差異，其在樹皮的表達(dá)量最高，在花中的表達(dá)量次之，在膠乳和葉片中的表達(dá)量相對較低（圖7-A）。乙烯利刺激后，膠乳中HbUBC5的表達(dá)在處理6 h后顯著上調(diào)并達(dá)到最大，隨后恢復(fù)到處理前水平（圖7-B）。

3 討論與結(jié)論

本研究在橡膠樹中克隆了一個(gè)新的巴西橡膠樹泛素結(jié)合酶基因HbUBC5，其編碼的蛋白具有典型的植物泛素結(jié)合酶結(jié)構(gòu)特征。HbUBC5與其他植物中相應(yīng)蛋白具有較高的同源性，而與橡膠樹中其他E2蛋白的同源性則較低，聚類分析也表明HbUBC5與橡膠樹中的其他E2蛋白進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，這說明不同植物中相應(yīng)的E2蛋白可能具有類似的結(jié)構(gòu)和功能，而同一植物中不同E2蛋白可能具有不同的生理功能。HbUBC5在所檢測的組織中均有表達(dá)，說明其可能廣泛參與了橡膠樹的生長發(fā)育。與HbUBC5進(jìn)化關(guān)系較近的擬南芥AtUBC19和AtUBC20已被證實(shí)在維持正常細(xì)胞功能和細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)及細(xì)胞分化過程中具有重要作用[19]。

植物在抵御環(huán)境脅迫、激素響應(yīng)和衰老的過程中會產(chǎn)生大量的異常蛋白，泛素蛋白酶體途徑是降解異常蛋白的重要途徑之一，泛素結(jié)合酶在這一過程中具有重要的功能[2，8，20]。Picton等[21]研究發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶基因在番茄葉片衰老過程中表達(dá)，并認(rèn)為其在衰老過程中具有重要作用。棉花泛素結(jié)合酶基因GhUBC1/2在葉片和花的衰老階段表達(dá)量迅速增加，在棉花衰老的過程中具有重要的調(diào)控作用[22]。乙烯是橡膠樹膠乳增產(chǎn)刺激劑，已廣泛應(yīng)用于天然橡膠的生產(chǎn)中，但乙烯同時(shí)也是一種植物衰老激素，在刺激橡膠樹增產(chǎn)的同時(shí)也會造成橡膠樹早衰和死皮等負(fù)面影響[23]。覃碧[24]的研究結(jié)果表明，泛素結(jié)合酶基因HbUBC22參與了橡膠樹乙烯的響應(yīng)過程，可能在橡膠樹產(chǎn)排膠調(diào)控過程中具有重要作用。本研究中也發(fā)現(xiàn)HbUBC5能被乙烯利顯著誘導(dǎo)表達(dá)，其啟動子區(qū)存在2個(gè)乙烯響應(yīng)元件ERE，這說明HbUBC5參與了橡膠樹對乙烯的響應(yīng)過程，并可能參與了乙烯利刺激橡膠樹產(chǎn)生副作用的過程。

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