孫學(xué)超　黃顧林　朱曉雯等

摘要[目的] 為肝素鈉的大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。[方法] 利用3種復(fù)合酶從腸渣中提取肝素鈉，通過測(cè)定提取肝素鈉的質(zhì)量、蛋白含量以及效價(jià)對(duì)3種復(fù)合酶法進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果]由木瓜蛋白酶和鏈蛋白酶復(fù)合酶提取的肝素鈉中蛋白含量最高（47%），效價(jià)為15 USPU/mg；由胰蛋白酶和鏈蛋白酶復(fù)合酶提取的肝素鈉中蛋白含量為29%， 而其效價(jià)為34 USPU/mg。由2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶提取的肝素鈉中蛋白含量最少（24%），效價(jià)最高（39 USPU/mg）。[結(jié)論] 2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶能有效提取腸渣中殘留的肝素鈉。

關(guān)鍵詞肝素鈉；腸渣；酶解；復(fù)合酶

中圖分類號(hào)S852文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）04-01074-01

基金項(xiàng)目江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐項(xiàng)目（BE2012400）。

作者簡(jiǎn)介孫學(xué)超（1987- ），男，山東惠民人，碩士，從事多糖類藥物研究。*通訊作者，高級(jí)經(jīng)濟(jì)師，從事腸衣及肝素鈉的經(jīng)營(yíng)及相關(guān)技術(shù)、工藝研究。

肝素主要來源于動(dòng)物富含肥大細(xì)胞的組織（如肝、肺、內(nèi)腸等），以O(shè)-連接形式與核心蛋白（Core protein，CP）形成肝素蛋白聚糖（Heparin proteoglycan，HepPG）形態(tài)存在[1]。肝素可以與百余種蛋白（如LDL、VLDL、LPL、SOD、AT Ш、IgG等）相互作用，呈現(xiàn)出降血脂[2]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]、抗炎、抗腫瘤[5]、抗單純孢疹病毒[6]、抗凝血[7]等生物活性。肝素于1920年就開始其大規(guī)模制備研究，并于1935年應(yīng)用于臨床，是目前世界上產(chǎn)量和銷售量最大的來自天然的糖類藥物，10 mg肝素鈉能在4 h內(nèi)抑制500 ml血液凝固[8]，目前還沒有任何一種藥物可以代替它。在肝素生產(chǎn)中，鹽解法具有操作簡(jiǎn)單且提取的肝素中雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)從而被國(guó)內(nèi)有很多的廠家采用，但是鹽解法在高溫使蛋白變性時(shí)會(huì)包裹肝素鈉形成腸渣，造成了肝素鈉提取率降低的現(xiàn)象，從而帶來損失。腸渣蛋白中既有球狀蛋白亦有鏈狀蛋白，使用單一的酶很難對(duì)其酶解徹底。筆者利用3種復(fù)合酶對(duì)腸渣進(jìn)行酶解，提取夾雜在腸渣中的肝素鈉，從而為企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料供試腸渣取自南通天龍畜產(chǎn)品有限公司；綿羊血漿購自蒼山向明生化助劑廠；肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（BSA）（美國(guó)Sigma公司），2709堿性蛋白酶（≥100 000 U/g），購自北京博士奧生物科技有限公司）；胰蛋白酶（≥250 000 U/g），購自美國(guó)Sigma公司；鏈蛋白酶（≥7 000 U/g ），購自美國(guó)Sigma公司；木瓜蛋白酶（≥3 000 U/g），購自美國(guó)Sigma公司；乙醇、丙酮和氫氧化鈉等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器R200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BCHI公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海華康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；BT25s分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；UNIQUER20純水儀（銳思捷科學(xué)儀器有限公司）；UV2102 PCS 紫外可見分光光度計(jì)（日本尤尼柯公司）；真空干燥箱（化康實(shí)驗(yàn)儀器廠）；082恒溫磁力攪拌器（上海梅潁浦公司）；TDL40B型離心機(jī)（安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1木瓜蛋白酶和鏈酶復(fù)合酶酶解腸渣。將脫水脫鹽后烘干的腸渣粉碎，過40目篩，取5 g腸渣分散于200 ml TrisHCL（pH 6.5）中，加入木瓜蛋白酶0.5 g，60 ℃保溫?cái)嚢? h，調(diào)節(jié)pH至7.5，補(bǔ)加鏈蛋白酶0.1 g，55 ℃保溫2 h，將溫度升至100 ℃并保溫10 min，離心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，濃縮后醇沉，乙醇脫水后真空干燥得到MT。

1.3.2胰蛋白酶和鏈蛋白酶復(fù)合酶酶解腸渣。取5 g腸渣分散于200 ml TrisHCl（pH 8.0）中，加入胰蛋白酶0.5 g，40 ℃保溫?cái)嚢? h，調(diào)節(jié)pH至7.5，補(bǔ)加鏈蛋白酶0.1 g，55 ℃保溫2 h，將溫度升至100 ℃并保溫滅活10 min，離心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，濃縮后醇沉，乙醇脫水后真空干燥得到Y(jié)T。

1.3.32709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶酶解腸渣。取5 g腸渣分散于200 ml TrisHCl（pH 8.0）中，加入胰蛋白酶0.1 g，40 ℃保溫?cái)嚢? h，調(diào)節(jié)pH至9.0，補(bǔ)加2709堿性蛋白酶0.5 g，55 ℃保溫2 h，將溫度升至100 ℃并保溫滅活10 min，離心，上清置于截留分子量3 500 Da的透析袋中透析48 h，濃縮后醇沉，乙醇脫水后真空干燥得到JT。

1.3.4蛋白含量及效價(jià)的測(cè)定。采用Folin-酚法測(cè)定粗蛋白含量[9]。采用美標(biāo)法測(cè)定樣品效價(jià)。估測(cè)樣品效價(jià)，并將其配成8 USPU/mg的供試溶液，然后取管徑均勻、干凈的具塞試管，加入梯度濃度的效價(jià)為8 USPU/ml的肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，并加入羊血漿1.00 ml和0.25 %氯化鈣試液0.80 ml，塞蓋，搖勻使試管內(nèi)壁完全潤(rùn)濕后立即計(jì)時(shí)，37 ℃條件下放置1 h后，觀察并記錄各管凝血狀況，并按照以下公式計(jì)算供試液的效價(jià)：

效價(jià)=肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品V1/2供試液V1/2×估計(jì)效價(jià)

2結(jié)果與分析

MT、YT和JT均是通過酶解后通過截留分子量為3 500 Da透析袋透析完全。由表1可知，MT、YT和JT的蛋白含量分別為47 %、29%和24%（蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1），說明2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶較前2種復(fù)合酶更能解斷腸渣中蛋白，但其蛋白含量還有24 %需要運(yùn)用其他方法進(jìn)一步純化；MT、YT和JT的效價(jià)分別為15、34和39 USPU/mg，說明蛋白會(huì)影響肝素的效價(jià)。如果MT、YT和JT中只含蛋白和肝素，效價(jià)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于39 USPU/mg，據(jù)此推測(cè)MT、YT和JT中不僅含有肝素及蛋白或許有軟骨素類透明質(zhì)酸等抗凝活性較弱的糖類，有待進(jìn)一步研究。腸渣酶解后的酶解液提取完肝素后直接噴霧干燥獲得低分子量的腸膜蛋白。

3小結(jié)

筆者探討了以木瓜蛋白酶和鏈蛋白酶復(fù)合酶、胰蛋白酶和鏈蛋白酶復(fù)合酶以及2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶3種復(fù)合酶對(duì)腸渣進(jìn)行分解提取肝素鈉，并對(duì)MT、YT和JT的質(zhì)量、蛋白含量以及效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，其中由2709堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶提取的肝素（JT）中蛋白含量最低（24%），效價(jià)最高為39 USPU/mg，為以腸渣為原料提取肝素以及生產(chǎn)腸膜蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] LOGANATHAN D，WANG H M，MALLIS L M，et al.Structural variation in the antithrombin III binding site region and its occurrence in heparin from different sources[J].Biochemistry，1990，29（18）：4362-4368.

[2] KUMEROVA A O，SILOVA A A，LIA U.Effect of pantethine on post-heparin lipolytic activity and lipid peroxidation in the myocardium[J].Biulleten' Eksperimental'noi Biologiii Meditsiny，1991，111（1）：33-35.

[3] RAGAZZI E，CHINELLATO A.Heparin：pharmacological potentials from atherosclerosis to asthma[J].General Pharmacology：The Vascular System，1995，26（4）：697-701.

[4] GRACHER A H P，CIPRIANI T R，CARBONERO E R，et al.Antithrombin and heparin cofactor II-mediated inactivation of α-thrombin by a synthetic，sulfated mannogalactan[J].Thrombosis Research，2010，126（3）：180-187.

[5] SALAS A，SANS M，SORIANO A，et al.Heparin attenuates TNF-α induced inflammatory response through a CD11b dependent mechanism[J].Gut，2000，47（1）：88-96.

[6] GHOSH T，CHATTOPADHYAY K，MARSCHALL M，et al.Focus on antivirally active sulfated polysaccharides：from structure-activity analysis to clinical evaluation[J].Glycobiology，2009，19（1）：2-15.

[7] ANDERSSON L，BARROWCLIFFE T W，HOLMER E，et al.Anticoagulant properties of heparin fractionated by affinity chromatography on matrix-bound antithrombin III and by gel filtration[J].Thrombosis Research，1976，9（6）：575-583.

[8] GRIFFITH G C，SILVERGLADE A.SYMPOSIUM ON HEPARIN.INTRODUCTION.[J].The American Journal of Cardiology，1964，14：1.

[9] 王培培，于廣利，楊波，等.選育羊棲菜與野生羊棲菜中褐藻膠與褐藻糖膠組成分析[J].中國(guó)海洋藥物，2009（3）：39-43.