張永帥,王淼焱,孫俊良,梁新紅,張婷

（河南科技學院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

NO對黃曲霉產毒的影響研究

張永帥,王淼焱,孫俊良,梁新紅,張婷

（河南科技學院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

研究了不同濃度NO供體SNP和NO清除劑cPTIO對黃曲霉菌產毒的影響.結果表明：在黃曲霉培養(yǎng)過程中添加SNP能導致黃曲霉菌體內NO量增多,產毒量減少；當添加NO清除劑cPTIO時黃曲霉菌體內NO量降低,產毒量增加.SNP濃度為0.200 mmol/L時,黃曲霉產黃曲霉毒素的量為0.87 μg/mL,比不添加時降低了16.35 μg/mL,而且添加SNP的黃曲霉菌體NO熒光值明顯增高.說明NO對黃曲霉產毒有一定的抑制作用.

黃曲霉；黃曲霉毒素；NO；抑制作用

黃曲霉毒素（aflatoxin）,也稱作黃曲霉素,是一種有強烈生物毒性的化合物,常由黃曲霉及另外幾種霉菌在霉變的谷物中產生,如大米、豆類、花生等,是迄今為止所知最強的致癌物質之一[1-4].黃曲霉毒素主要有B1、B2、G1與G2等4種,又以B1的毒性最強.食米儲存不當,極易發(fā)霉變黃,產生黃曲霉毒素.黃曲霉毒素與肝癌有密切關系,還會引起組織失血、厭食等癥狀[5].1960年在英國發(fā)生了因喂食黃曲霉毒素花生粕而導致大批火雞暴斃事件.警惕黃曲霉毒素的危害,要注意剔除霉變的食物顆粒,還可采用以水淘洗的辦法進一步凈化易沾染的食物中的霉菌.當然,用高溫燒、炸至280℃以上也可以達到分解毒素和去除污染的效果.黃曲霉是產生黃曲霉毒素的主要菌種之一,因而,研究調控黃曲霉產毒機理成為當今熱點[6].

人們一直在致力尋找防治黃曲霉的方法,特別是2011年國家質檢總局查出蒙牛產品黃曲霉毒素M超標,迫使我們亟需尋求一個能夠有效控制黃曲霉污染的方法.自20世紀70年代以來,很多學者嘗試通過改良栽培技術、使用化學藥劑和生物控制等方法來克服這一棘手問題[7-9].NO作為人體內的信使分子,它不需要任何中介機制就可快速擴散通過生物膜,將一個細胞產生的信息傳遞到它周圍的細胞中,主要影響因素是它的生物半衰期.具有多種生物功能的原因在于它是自由基,極易參與傳遞電子反應,加入機體的氧化還原過程中.分子的配位性又使它與血紅素鐵和非血紅素鐵具有很高的親合力,以取代O2和CO2的位置.據研究報道,血紅蛋白-NO可以失去它附近的堿基而變成自由的原血紅素-NO,這就意味著自由的堿基可以自由地參與催化反應,自由的蛋白質可以自由地改變構象,自由的血紅素可以自由地從蛋白中擴散出去,這三種變化中的任何一個或它們的組合,將在鳥苷酸環(huán)化酶的活化過程中起重要作用.NO的生物學作用和其作用機制研究方興未艾,它的發(fā)現提示著無機分子在醫(yī)學領域中研究的前景.

有些報道還提出NO參與植物的調節(jié)[10],那么NO是否參加黃曲霉產毒的調控呢？這個問題至今還未見報道.本研究通過使用NO的供體SPN、NO清除劑cPTIO、NO熒光探針等方法來研究NO對黃曲霉產毒的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃曲霉模式菌株,購自中國工業(yè)微生物菌種管理保藏中心；黃曲霉毒素B1（aflatoxinB1AFB1）,由江蘇省農業(yè)科學院贈送；乙腈、甲醇、AFB1標準品為色譜純,其余試劑均為分析純.

VariosKan Flash（美國Thermo公司）；2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BM-38XBV熒光顯微鏡（日本尼康公司）；SW-CJ-1D單人單面垂直送風（經濟型）凈化工作臺（中國蘇州智凈凈化有限公司）；MTN-2800W氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；Heidolph VV2000旋轉蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；ZHWI-Z11C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；SHP型生化培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海中安醫(yī)療器械廠）.

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸浮液制備 取保存的黃曲霉菌接種于PDA平板上,30℃下培養(yǎng)4 d,待黃曲霉長滿平板后,將無菌Tritonx-100（0.1%）5 mL注入平板,輕搖使黃曲霉孢子均勻分散,取懸液用血球計數板在顯微鏡下計數,稀釋成1×106CFU/mL待用,黃曲霉孢子要現制現用[11].

1.2.2 不同濃度SNP下黃曲霉產毒量的測定 在滅好菌的沙氏培養(yǎng)基中添加不同濃度的SNP,使其最終濃度分別為0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275、0.300、0.400、0.600、0.800、1.000和1.200 mmol/L,將制備好的孢子懸浮液接種于沙氏培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)48 h,待測.

1.2.3 不同濃度NO清除劑cPTIO 下黃曲霉產毒量的測定在滅好菌的沙氏培養(yǎng)基中添加不同濃度的cPTIO,使其最終濃度分別為0.100、0.150和0.200 mmol/L,將制備好的孢子懸浮液接種于沙氏培養(yǎng)基中, 30℃培養(yǎng)48 h,待測.

1.2.4 AFB1提取及含量測定 吸取一定量提取液,加3倍氯仿萃取,萃取液于60℃用氮吹儀吹干,溶解在甲醇中,過0.22 m微孔濾膜,然后用HPLC測定.色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-ⅠⅠPacked Column（4.6 mmI.D.×250 mm）（上海泉島公司）；柱溫：22℃；進樣量：10 μL；檢測波長：365 nm；流動相：V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=1∶1∶2；流速：1 mL/min[12].

1.2.5 NO熒光值的測定 在3瓶滅好菌的沙氏培養(yǎng)基中分別添加等量的無菌水、SNP、cPTIO,使其SNP和cPTIO最終濃度分別為0.250、0.100 mmol/L,將制備好的孢子懸浮液接種于沙氏培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)48 h,分別取3種菌液1 mL放入1.5 mL離心管中,每管添加5 μL DAF-FM溶液,混勻,取2 μL混合液滴到載玻片上,蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡上觀察拍照.另外分別取200 μL混合液放入96孔板A01-A03用VariosKan Flash在激發(fā)波長495 nm,發(fā)射波長515 nm下測熒光值.

1.3 數據分析

試驗重復3次,AFB1產量平均值利用SPSS軟件平臺中SNK法進行統(tǒng)計分析.

2 結果與分析

2.1 SNP對黃曲霉產毒的影響

SPN添加量對黃曲霉毒素抑制率的影響見圖1.SNP添加量對黃曲霉產毒量的影響見圖2.

圖1 SNP對黃曲霉毒素抑制率的影響Fig.1 The effect of SNP on aflatoxin inhibition rate

圖2 SNP對黃曲霉毒素產量的影響Fig.2 The effect of SNP on aflatoxin production

由圖1可知,當SNP添加濃度為0.200 mmol/L時對黃曲霉產黃曲霉毒素的抑制率為64%,SNP添加濃度≥0.4 mmol/L時對黃曲霉產毒的抑制率均為100%.由圖2可知,不加SNP的黃曲霉產毒量為17.28 μg/mL,SNP添加濃度為0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275和0.300 mmol/L時黃曲霉的產毒量分別為7.80、11.53、0.87、2.79、4.98、6.73和10.22 μg/mL,與對照相比添加SNP的黃曲霉產毒量都有所下降,SNP濃度為0.200 mmol/L時黃曲霉產毒量最小為0.87 μg/mL,遠遠低于對照的產毒量,說明SNP確實參與了黃曲霉產毒的調控.

2.2 NO清除劑cPTIO對黃曲霉產毒的影響

NO清除劑cPTIO添加量對黃曲霉產毒的影響見圖3.

圖3 NO清除劑cPTIO對黃曲霉產毒的影響Fig.3 The effect of NO scavenger cPTIO on aflatoxin toxin-producing

由圖3可知,添加NO清除劑cPTIO的濃度為0.100、0.150和0.200 mmol/L時黃曲霉產毒素的量分別為20.56、21.74和21.73 μg/mL,不添加NO清除劑cPTIO（對照）的黃曲霉產毒素的量為17.22 μg/mL.添加NO清除劑cPTIO后黃曲霉產毒素量增加,說明NO參與調控黃曲霉產毒.

2.3 不同處理下黃曲霉菌體內NO熒光值的變化

3種處理下黃曲霉菌體內NO熒光強度的變化見圖4.

圖4 不同處理下黃曲霉菌體內NO的熒光強度Fig.4 The fluorescence intensity of NO in Aspergillus flavus under different treatments

由圖4可知,添加SNP的濃度為0.250 mmol/L時黃曲霉菌體在熒光顯微鏡下可以看到明顯的熒光；對照黃曲霉菌體在熒光顯微鏡下可以看到微弱的熒光值；而添加NO清除劑cPTIO的黃曲霉菌體在熒光顯微鏡下沒有看到熒光.

3種處理下黃曲霉熒光值的變化見圖5.

圖5 不同處理下黃曲霉的熒光值Fig.5 The aflatoxin fluorescence value under different treatments

由圖5可知,添加SNP的濃度為0.250 mmol/L時黃曲霉菌體用VariosKan Flash在激發(fā)波長495 nm.發(fā)射波長515 nm下測得DAF-FM熒光值為66.87；對照黃曲霉菌體測得DAF-FM熒光值為24.1；而添加NO清除劑cPTIO的黃曲霉菌體熒光值為0.

3 結論

在黃曲霉培養(yǎng)過程中添加SNP能導致黃曲霉菌體NO量增強,導致黃曲霉產毒量減少；當添加NO清除劑cPTIO時黃曲霉菌體NO量減弱,導致黃曲霉產毒量增加；當SNP添加量在0.200 mmol/L時,黃曲霉產毒素的量為0.87 μg/mL,比不添加時降低了16.35 μg/mL.說明NO抑制黃曲霉產生毒素,其機理還需要進一步研究.

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（責任編輯：鄧天福）

Effect of NO on aftatoxin production of Aspergillus flavus

Zhang Yongshuai,Wang Miaoyan,Sun Junliang,Liang Xinhong,Zhang Ting
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

The effects of different concentrations of NO donor SNP andNO scavenger cPTIO on aflatoxin production ofA spergillus flavuswas weinvestigated in this study.The results showed that：SNP is added in the process ofA.flavustraining can lead to NO increase in the number of quantity,reduce the amount of aflatoxin toxinproducing,A.flavusNO amount reduced and leading toA.flavustoxin-producing quantity increase when adding NO scavenger cPTIO,A spergillus flavusproducing aflatoxin is 0.87 μg/mL,lower than when no added（including 16.35μg/mL）and add the SNPA.flavusNO fluorescence value is significantly increased when the amount of addition of SNP is 0.200 mmol.NO toA.flavustoxin-producing has certain inhibitory effect.

Aspergillus flavus；aflatoxin；NO；inhibition

TS201.3

A

1008-7516（2014）03-0026-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.03.006

2014-05-04

國家自然科學基金項目（311641/C200101）；河南省科技計劃項目（122102110037）

張永帥（1987-）,男,河南許昌人,碩士研究生.主要從事食品生物技術研究.

孫俊良（1964-）,男,河南新鄉(xiāng)人,博士,教授,碩士生導師.主要從事食品生物技術與酶制劑工程研究.