曹秀榮尹乃達(dá)彭國(guó)富

論著·實(shí)驗(yàn)研究

羧甲基殼聚糖專屬性檢驗(yàn)方法研究及應(yīng)用

曹秀榮1尹乃達(dá)2彭國(guó)富3

目的探討羧甲基殼聚糖的定性鑒別及含量測(cè)定的專屬性方法。 方法本文將紅外光譜法、乙酰丙酮法、二硝基水楊酸比色法這三種方法結(jié)合起來，從化學(xué)結(jié)構(gòu)、特異性顯色及含量測(cè)定方面對(duì)其羧甲基殼聚糖進(jìn)行特異性鑒別及含量測(cè)定研究。 結(jié)果 該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，能廣泛用于羧甲基殼聚糖及其制品的檢驗(yàn)。結(jié)論給后續(xù)羧甲基殼聚糖國(guó)標(biāo)或行標(biāo)的制定提供參考。

羧甲基殼聚糖；鑒別；含量；專屬性

1 前言

羧甲基殼聚糖是殼聚糖與氯代乙酸在一定條件下反應(yīng)得到的水溶性殼聚糖產(chǎn)物，具有良好的吸濕性、保濕性、成膜性以及生物相容性，羧甲基殼聚糖及其制品（敷料）目前廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1,2]，羧甲基殼聚糖及其制品（敷料）廣泛用于在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是臨床骨科領(lǐng)域，如開放性骨科手術(shù)、脊柱骨手術(shù)、內(nèi)置骨釘、骨板手術(shù)、人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)等都有臨床應(yīng)用。對(duì)于外皮層縫合后，羧甲基殼聚糖及其制品（敷料）能起到止血、止痛、抑菌、促進(jìn)傷口愈合的作用。在換藥過程不粘連傷口，避免造成傷口二次損傷；減少疤痕形成。對(duì)于骨科長(zhǎng)期臥床引起的褥瘡傷口后期，也有治療作用。殼聚糖用作復(fù)合仿生材料可以有效增強(qiáng)殼聚糖自身機(jī)械性能及溶劑性能，在骨科修復(fù)及整個(gè)醫(yī)療領(lǐng)域都會(huì)越來越受到人們的關(guān)注[3]。

目前，羧甲基殼聚糖定性鑒別以及含量測(cè)定方法，尚無嚴(yán)格的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)參考，研究者們多以單一的方法嘗試建立標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法，例如用于羧甲基殼聚糖結(jié)構(gòu)鑒定的方法有紅外光譜法[4]、核磁光譜法等，用于羧甲基殼聚糖含量測(cè)定的方法有乙酰丙酮法[2]、斐林試劑法、硫酸蒽酮法、二硝基水楊酸比色法[5]等。然而，這些方法對(duì)于單一組分的羧甲基殼聚糖的結(jié)構(gòu)鑒定以及含量測(cè)定準(zhǔn)確度高，但是對(duì)于復(fù)雜體系下羧甲基殼聚糖的結(jié)構(gòu)鑒定以及含量測(cè)定往往差異性大，難以滿足檢驗(yàn)的要求。為此，我們利用羧甲基殼聚糖結(jié)構(gòu)鑒定的方法，借鑒含量測(cè)試方法中乙酰丙酮法中的顯色反應(yīng)，結(jié)合二硝基水楊酸比色法，綜合提出羧甲基殼聚糖的專屬性檢驗(yàn)方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，能廣泛用于羧甲基殼聚糖及其制品的檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 儀器與試劑

主要儀器：紫外可見分光光度計(jì)（UV-1750型，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet5700型，美國(guó)熱電公司）。

主要試劑：羧甲基殼聚糖、瑞蒙復(fù)殼聚糖醫(yī)用生物創(chuàng)面修復(fù)膜產(chǎn)品（人福醫(yī)藥集團(tuán)醫(yī)療用品有限公司），其它試劑均為國(guó)產(chǎn)商品試劑，分析純。

2.2 紅外光譜測(cè)試

將羧甲基殼聚糖粉末與KBr粉末研磨壓片，置于傅里葉變換紅外光譜儀樣品室，在4000～400cm-1范圍進(jìn)行掃描。

2.3 顯色反應(yīng)測(cè)試

乙酰丙酮溶液配制：取乙酰丙酮3.5 ml，加入1 mol/L碳酸鈉溶液至50 ml，搖勻混溶即可。對(duì)-二甲氨基苯甲醛溶液配制如下：取對(duì)-二甲氨基苯甲醛固體0.8g，加無醛乙醇15ml及鹽酸15 ml，搖勻備用

分別取羧甲基殼聚糖①、羧甲基纖維素鈉②、聚乙烯醇③、瑞蒙復(fù)殼聚糖醫(yī)用生物創(chuàng)面修復(fù)膜產(chǎn)品去掉羧甲基殼聚糖膜層后剩余敷芯層④、瑞蒙復(fù)殼聚糖醫(yī)用生物創(chuàng)面修復(fù)膜⑤作為測(cè)試樣品。①、②、③組各配置成5%的溶液，取出2 ml置于100ml錐形瓶中；④、⑤兩組直接置于100ml錐形瓶中，各加入濃鹽酸20 ml、再補(bǔ)加去離子水20 m（l滴加時(shí)沖凈殘留在瓶口周圍的濃鹽酸），稍加振搖后用白膠塞或特氟龍瓶塞塞緊。將上述5組錐形瓶置于高壓蒸汽滅菌鍋中，120℃下水解2小時(shí)后取出冷卻至室溫。取④、⑤上層清液各5 ml于兩只50 ml燒杯中，用6mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性后作為檢驗(yàn)樣液及對(duì)照液備用。

乙酰丙酮法顯色：分別取上述檢驗(yàn)樣液各1 ml于10 ml比色管中，并加5.0 ml去離子水稀釋之。再加乙酰丙酮溶液各1.0 ml，搖勻，同時(shí)置于沸水浴中加熱約25分鐘后一并取出，在流動(dòng)水下迅速冷卻；再各加對(duì)-二甲氨基苯甲醛溶液1.0 ml，補(bǔ)充無醛乙醇至10 ml，搖勻，在60℃水浴中保溫1小時(shí)后放冷比色，觀察比色結(jié)果。

斐林試劑法顯色：分別取上述檢驗(yàn)樣液2ml置于試管中，加5.0 ml去離子水稀釋后，再加斐林試劑0.2ml，搖勻后于沸水浴中加熱約2～3分鐘后取出，觀察顯色結(jié)果。

2.4 二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)羧甲基殼聚糖含量

配置DNS試劑：甲溶液：溶解6.9 g結(jié)晶酚于15.2 ml 10 %氫氧化鈉中并加水稀釋至69 ml，再向此溶液中加入6.9 g亞硫酸氫鈉；乙溶液：溶解255 g酒石酸鉀鈉于300 ml 10%氫氧化鈉中，再加入880 ml濃度為1%的3,5-二硝基水楊酸溶液。將甲乙溶液混合即成DNS試劑。

反應(yīng)原液制備：取瑞蒙復(fù)殼聚糖醫(yī)用生物創(chuàng)面修復(fù)膜，剪成2.5cm×2.5cm置于100ml錐形瓶?jī)?nèi)，添加20ml濃鹽酸和20ml純凈水，封口后120℃高溫蒸汽水解反應(yīng)。待冷卻后過濾取得其上清液體，用氫氧化鈉中和至中性，得到反應(yīng)原液。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線建立：從2%羧甲基殼聚糖溶液中分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置于10 ml試管中，加水至2ml，再分別加入0.1%氫氧化鈉一滴，加入DNS試液1ml，混勻置沸水浴中顯色5分鐘，冷卻后加水稀釋至10ml，以空白為對(duì)照，于520 nm處測(cè)定吸收值，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

樣品中羧甲基殼聚糖含量測(cè)試：分別取1、2、3ml反應(yīng)原液置于10ml試管中，加入1 mlDNS試劑，混勻置沸水浴中顯色5分鐘，冷卻后加水稀釋至10 ml，以空白為對(duì)照，于520 nm處測(cè)定吸收值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外光譜

圖1為羧甲基殼聚糖紅外光譜圖。圖1顯示，1602 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，歸屬于羧甲基殼聚糖分子鏈上COO—反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰（約1550 cm-1）與NH2變形振動(dòng)峰（1599 cm-1）重疊形成。1115 cm-1（C-O-C）、1081cm-1（C-O-C）、893cm-1（NH）吸收峰的出現(xiàn)，表示羧甲基在殼聚糖2位氨基、6位羥基同時(shí)發(fā)生取代。

圖1 羧甲基殼聚糖紅外光譜圖

3.2 顯色反應(yīng)

羧甲基殼聚糖水解成氨基葡萄糖后，在堿性條件下加熱，乙酰丙酮將氨基葡萄糖分子2號(hào)碳位上的氨基乙?；?，生成帶有吡咯環(huán)的 N-乙酰衍生物。此衍生物與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，反應(yīng)物呈現(xiàn)紅色。圖2是各種樣品的乙酰丙酮顯色圖。從圖中可以看出，純羧甲基殼聚糖呈現(xiàn)桃紅色，瑞蒙復(fù)殼聚糖醫(yī)用生物創(chuàng)面修復(fù)膜呈現(xiàn)紫紅色，兩組含有羧甲基殼聚糖的樣品都呈現(xiàn)出氨基葡萄糖的特異性顏色反應(yīng)（紅色），而不含有羧甲基殼聚糖的樣品呈現(xiàn)黃色。(圖2各種樣品的乙酰丙酮法顯色圖詳見插頁）

羧甲基殼聚糖水解成氨基葡萄糖后，氨基葡萄糖與Cu2+作用，將其還原成Cu+，形成Cu2O磚紅色沉淀。圖3是各種樣品的斐林試劑顯色圖。從圖中可以看出，純羧甲基殼聚糖呈現(xiàn)磚紅色，而其它幾種含羧甲基殼聚糖或不含羧甲基殼聚糖組分的樣品均呈現(xiàn)不同的顏色：羧甲基纖維素鈉呈現(xiàn)淡藍(lán)色、聚乙烯醇呈現(xiàn)淡藍(lán)混濁、不含羧甲基殼聚糖敷芯呈現(xiàn)綠色、瑞蒙復(fù)殼聚糖醫(yī)用生物創(chuàng)面修復(fù)膜呈現(xiàn)淡橙色。磚紅色沉淀是還原性單糖的特異性顏色反應(yīng)，純羧甲基殼聚糖因其水解成還原性單糖，所以呈現(xiàn)此顏色反應(yīng)。然而含有羧甲基殼聚糖的瑞蒙復(fù)殼聚糖醫(yī)用生物創(chuàng)面修復(fù)膜由于其它高分子組分的呈色干擾，顏色變?yōu)榈壬?。其它不含羧甲基殼聚糖呈現(xiàn)藍(lán)綠色色系。由此可以看出，斐林試劑顯色法用于鑒別羧甲基殼聚糖，其呈色易受到其它成分的影響而呈現(xiàn)非特異性顏色反應(yīng)。相比較而言，乙酰丙酮法更合適用于羧甲基殼聚糖的鑒別反應(yīng)。（圖3各種樣品的斐林試劑顯色圖詳見插頁）

3.3 DNS法測(cè)羧甲基殼聚糖含量

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立：羧甲基殼聚糖溶液濃度分別為0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 ml的測(cè)試溶液，對(duì)應(yīng)測(cè)得的吸光度測(cè)得值分別為0.314、0.624、0.941、1.217、1.607。對(duì)上述5組數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，得到擬合方程，即標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程，為：y=0.01969+1.25485x，r2=0.99864。

反應(yīng)原液取量分別為1、2、3 ml，測(cè)得的吸光度分別0.028、0.051、0.092代入標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算其濃度分別為0.0548、0.0836、0.1351mg/ml，結(jié)合測(cè)試反應(yīng)原液體積以及所使用的瑞蒙復(fù)殼聚糖醫(yī)用生物創(chuàng)面修復(fù)膜規(guī)格數(shù)據(jù)，計(jì)算瑞蒙復(fù)殼聚糖醫(yī)用生物創(chuàng)面修復(fù)膜中羧甲基殼聚糖平均含量為1.133mg/cm2，跟該產(chǎn)品配方用羧甲基殼聚糖配比接近，說明其方法用于羧甲基殼聚糖含量測(cè)定時(shí)具有較高的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

市場(chǎng)上羧甲基殼聚糖及其制品越來越多，用途越來越廣泛，因此建立行之有效的檢驗(yàn)方法顯得尤為必要。本文從羧甲基殼聚糖鑒別及含量測(cè)定特異性方法入手，以紅外光譜法表征羧甲基殼聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)，以顯色方法（斐林試劑法和乙酰丙酮法）鑒別羧甲基殼聚糖的存在，以二硝基水楊酸比色法測(cè)定羧甲基殼聚糖的含量。結(jié)果表明，斐林試劑法由于受到非羧甲基殼聚糖組分的干擾，呈色偏離磚紅色（目標(biāo)色），偏差大。而其它幾種方法如紅外光譜法、乙酰丙酮法、二硝基水楊酸比色法都表現(xiàn)出特異性特征。因此，將紅外光譜法、乙酰丙酮法、二硝基水楊酸比色法結(jié)合起來，分別從羧甲基殼聚糖基本化學(xué)結(jié)構(gòu)、特異性顯色反應(yīng)、含量測(cè)定方面，對(duì)其進(jìn)行定性鑒別及含量測(cè)定，形成羧甲基殼聚糖專屬性檢驗(yàn)方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，能廣泛用于羧甲基殼聚糖及其制品的檢驗(yàn)。

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Research and application of carboxymethyl chitosan specificity detection

Cao Xiurong1,Yin Naida2,Peng Guofu3.1Hubei Food and Drug Administration,Wuhan Hubei,430064;2Humanwell Medical Group Medical Supplies Co.,Ltd,Wuhan Hubei,430206;3Laboratory of Biological Functional Dressings of Hubei Province,Wuhan Hubei,430064,China

Objective The paper is seeking for a method of identification and determination of content of carboxymethyl chitosan.Methods Three methods including Infrared Spectroscopy Way,Acetyl Acetone Way and Dinitrosalicylic Acid Way are combined to identify and determine the content of carboxymethyl chitosan from three aspects,including chemical structure，specific color and content determination.Results The result shows that we could get the result conveniently and quickly，and the result is accurate by the way.Conclusion The method could be a important reference for draft of national standards or industry standards of carboxymethyl chitosan

Carboxymethyl chitosan;Identification;Content;Specificity

R318.08

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2014.04.005

swgk2014-03-0045

曹秀榮(1972-)女，本科，高級(jí)工程師。工作方向：醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)審評(píng)。

2014-03-24）

1湖北省食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)認(rèn)證中心，湖北武漢430064；2人福醫(yī)藥集團(tuán)醫(yī)療用品有限公司，湖北武漢430206；3人福醫(yī)藥集團(tuán)醫(yī)療用品有限公司，生物功能性敷料創(chuàng)制湖北省工程實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430206