李秀賢 ,柏丹鳳,田金苗,王怡君
(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,遼寧 沈陽(yáng) 110034; 2.上海新先鋒藥業(yè)有限公司,上海 201203;3.遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所,遼寧 沈陽(yáng) 110023)
腎炎溫陽(yáng)片由黃芪、大黃、人參、附子(鹽制)、黨參、茯苓、肉桂、香加皮、木香、白術(shù)、葶藶子等組方,具有溫腎健脾、化氣行水的功效,用于慢性腎炎,癥見脾腎陽(yáng)虛、全身浮腫、面色蒼白、脘腹脹滿、納少便溏、神倦尿少。原標(biāo)準(zhǔn)收載于《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第三冊(cè)(1998年),有顯微鑒別人參、理化鑒別大黃、薄層鑒別大黃和香加皮,沒有含量測(cè)定項(xiàng)。為更好地控制本品質(zhì)量,在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了大黃酚含量測(cè)定項(xiàng),經(jīng)對(duì)樣品進(jìn)行檢驗(yàn),該標(biāo)準(zhǔn)能有效地控制腎炎溫陽(yáng)片的質(zhì)量?,F(xiàn)報(bào)道如下。
LC-2010C型高效液相色譜儀(日本島津公司)。大黃酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)為110796-200514);腎炎溫陽(yáng)片(遼寧好護(hù)士藥業(yè)<集團(tuán)>有限責(zé)任公司,批號(hào)為 111201,111202,111203;甲醇、乙腈(色譜純,天津市康科德科技有限公司),重蒸水,其他試劑為分析純。
色譜柱:Waters C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇 -0.1% 磷酸溶液(85 ∶15);流速:1 mL /min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;柱溫:30℃。理論板數(shù)按大黃酚峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。
取大黃酚對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液,即得對(duì)照品溶液。取本品20片,除去糖衣,精密稱定,研細(xì),取約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加甲醇40 mL,超聲處理(功率250 W,頻率33 kHz)30 min,放冷,濾過(guò),用少量甲醇洗滌錐形瓶及濾器,合并濾液,置水浴上蒸干,殘?jiān)?%鹽酸溶液10 mL,再加三氯甲烷10 mL,加熱回流1 h,放冷,置分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗滌容器,洗液并入分液漏斗中,分取三氯甲烷層,酸液再用三氯甲烷振搖提取3次,每次10 mL,合并三氯甲烷液,水浴蒸干,殘?jiān)蛹状际谷芙猓⑥D(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得供試品溶液。按處方比例制備缺大黃的陰性樣品,再按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。
陰性干擾試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL,分別注入高效液相色譜儀,繪制色譜圖。可見,在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上,供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰,而陰性對(duì)照品溶液在此峰處無(wú)干擾。在此色譜條件下,大黃酚可與其他成分基線分離。結(jié)果見圖1。
圖1 高效液相色譜圖
線性關(guān)系考察:精密稱取大黃酚對(duì)照品9.20 mg,用甲醇轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并定容至刻度,搖勻;精密吸取1 mL至10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,制成每1 mL含大黃酚0.009 2 mg的對(duì)照品溶液。分別精密吸取大黃酚對(duì)照品溶液 1,5,10,25,50 μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜峰面積,以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=1 296 895.025 1 X -914.661 3,r=0.999 9。結(jié)果表明,大黃酚進(jìn)樣量在 0.009 2~0.460 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。
精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積。結(jié)果大黃酚峰面積的 RSD為0.2%,表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液10 μL,分別于配制后 0,10,16,22,30 h 時(shí)進(jìn)樣分析,測(cè)定峰面積。結(jié)果大黃酚峰面積的 RSD為0.6%,表明供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定。
重復(fù)性試驗(yàn):取本品(批號(hào)為111201)約1.0 g,精密稱定,共取6份,按供試品溶液制備方法測(cè)定,注入高效液相色譜儀中,測(cè)定峰面積,計(jì)算含量。結(jié)果平均含量為 0.879 8 mg/g,RSD為1.0%,表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。
加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知準(zhǔn)確含量的同一批樣品(批號(hào)為 111201)6份,各 0.5 g,分別精密加入大黃酚對(duì)照品溶液(0.092 g /L)4,5,6 mL,按照供試品溶液制備方法操作,測(cè)定加標(biāo)樣品中大黃酚的含量,計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。
按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液,依法測(cè)定。結(jié)果 3批腎炎溫陽(yáng)片中大黃酚的含量分別為 0.879 8,0.881 1,0.877 2 mg /g。
取大黃酚對(duì)照品的甲醇溶液,在200~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,結(jié)果大黃酚的最大吸收波長(zhǎng)為254 nm,同時(shí)參考2010年版《中國(guó)藥典(一部)》大黃含量測(cè)定項(xiàng),故選定254 nm為大黃酚的測(cè)定波長(zhǎng)[5-7]。在本方中黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫的功效,在處方中量最大,為君藥,考慮增加黃芪甲苷的含量測(cè)定,但經(jīng)試驗(yàn),黃芪甲苷含量測(cè)定的回收率過(guò)低,不能達(dá)到中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求,故未增加黃芪甲苷的含量測(cè)定。在本方中大黃具有清熱瀉火的功效,在處方中量較大,為臣藥,原標(biāo)準(zhǔn)中有大黃的理化鑒別,專屬性不強(qiáng),還有大黃的薄層鑒別,方法較成熟,作為定性鑒別專屬性強(qiáng),為了更好地控制本品的質(zhì)量,本次試驗(yàn)考察了大黃中大黃酚的含量測(cè)定,方法簡(jiǎn)單、可靠,可作為腎炎溫陽(yáng)片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
表1 大黃酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
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