吳楊 張圓 閔春艷 郝剛 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州 215104）

輔助降血糖類保健食品非法添加化學(xué)物質(zhì)檢測方法研究

吳楊 張圓 閔春艷 郝剛 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州 215104）

目的：利用超高效液相-串聯(lián)四級桿-飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS），建立快速可靠靈敏的測定輔助降血糖類保健食品中非法添加二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲和格列喹酮13種化學(xué)藥品的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法。方法：采用UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS檢測，以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18為填充柱；0.1%甲酸-0.01 mol/L乙酸銨水溶液和甲醇梯度洗脫，流速0.3 mL/min；ESI正離子模式，一級、二級質(zhì)譜全掃描，進(jìn)行UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的定性及定量分析。結(jié)果：此方法經(jīng)過驗(yàn)證，線性良好（r＞0.99）、精密度RSD＜3%、樣品回收率在74.1%～ 90.0%之間，檢出限在9.29～ 60.0 ng/mL之間，均能滿足輔助降血糖類保健食品非法添加化學(xué)成分篩查的要求。結(jié)論：此方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、分離度高，可為輔助降血糖類保健食品非法添加篩查檢測提供有力工具。

超高效液相-串聯(lián)四級桿-飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)；輔助降血糖；保健食品；非法添加化學(xué)物質(zhì)

隨著生活水平的提高，人們越來越關(guān)注自身的健康狀況，對保健食品的需求逐年增加，但在保健食品中非法添加化學(xué)成分的現(xiàn)象目前相當(dāng)嚴(yán)重，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的身心健康和經(jīng)濟(jì)利益，產(chǎn)生的不良反應(yīng)甚至危及百姓生命。

目前市場上聲稱輔助降血糖類的保健食品常見的添加化學(xué)物質(zhì)主要有：雙胍類降糖藥；磺酰脲類降糖藥（如甲苯磺丁脲及格列奈類）；噻唑烷二酮類降糖藥（如羅格列酮、吡格列酮）等。這些保健食品長期使用會造成病人出現(xiàn)較強(qiáng)的副作用，甚至有死亡的危險(xiǎn)。

目前國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件共有 3個文件（批準(zhǔn)件編號2009029，2011008，2013001）對降血糖類保健食品和中成藥進(jìn)行非法添加化學(xué)藥品的篩查和驗(yàn)證，包括 13種化學(xué)藥品，共需用 3個液相系統(tǒng)方法，耗時(shí)且繁瑣。已有文獻(xiàn)報(bào)道[1-5]，篩查的降血糖類化學(xué)藥物較少，未能全部覆蓋目前3個系統(tǒng)的全部降血糖類對照品。本實(shí)驗(yàn)擬建立快速、高效、準(zhǔn)確篩查降血糖類保健食品非法添加化學(xué)物質(zhì)的方法，在同一系統(tǒng)中完成13種藥物的篩查。利用超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿-飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS），建立快速可靠靈敏的測定輔助降血糖類保健食品中違法添加二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲、格列喹酮13種化學(xué)藥品的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，覆蓋現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的所有非法添加物質(zhì)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國安捷倫公司 1290 Infinity-6538-Q-TOF超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿-飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀；ML204電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；Millipore公司Milli-Q純水儀。

Q-TOF定性軟件：Mass Hunter Workstation Software Qualitative Analysis Version B.05.00 Build 5.0.519.13。

PCDL軟件：Mass Hunter PCDL Manager Version B.04.00 Build 92.0。

1.2 試劑信息

甲醇，MERCK公司，LC-MS級；甲酸，MERCK公司，LC-MS級；乙酸銨，SIGMA-ALDRICH公司，LC-MS級；水為Milli-Q純水儀制去離子水。

1.3 對照品信息

13 種對照品二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲、格列喹酮均來自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于99%。

1.4 樣品信息

7批樣品均來自于各級食品藥品監(jiān)督管理局市場抽樣。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，Rapid Resolution HD，2.1×100 mm，1.8-Micron填料粒徑；DAD（二極管陣列）檢測器，檢測波長230 nm；掃描波長范圍190～ 400 nm，步長（step）：2 nm。流動相：A（0.1%甲酸-10 mmol乙酸銨水溶液）、B（甲醇），流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃。進(jìn)樣體積：1 μL。洗脫梯度：時(shí)間 （min）/B%∶0 min 10%，5 min 55%，13 min 95%，15 min 95%，后運(yùn)行時(shí)間（post runtime）∶2 min。13種宣稱輔助降血糖類非法添加成分的一級提取離子流色譜疊加圖見圖1。

圖1 13種宣稱輔助降血糖類非法添加成分一級提取離子流色譜疊加圖

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化源（ESI）；毛細(xì)管溫度 350℃；干燥氣流量 10 L/min；霧化氣壓力 40 psi；噴霧電壓 3 500 V；破碎電壓（fragmentor）135 V；正離子檢測方式；掃描方式為一級、二級質(zhì)譜全掃描。二級碎片碰撞能量見表1。

表1 13種輔助降血糖類保健食品非法添加成分相關(guān)色譜、質(zhì)譜信息

2.3 對照品溶液的制備

取二甲雙胍、丁二胍、苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列齊特、吡格列酮、羅格列酮、格列波脲、格列吡嗪、瑞格列奈、格列美脲、格列本脲和格列喹酮對照品各約5 mg，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為單標(biāo)儲備液。再分別取各單標(biāo)儲備液1 mL置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成含上述各對照品10 μg/mL的混合標(biāo)樣，供進(jìn)樣分析。

2.4 供試品溶液的制備

若供試品為固體制劑，精密稱取一次服用量，研細(xì)后轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇約8 mL，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，取適量上清液至2 mL離心管，離心5分鐘，取上清液100 μL并用甲醇稀釋至1 mL，即得。

若供試品為液體制劑，精密量取一次服用量，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15分鐘，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。量取續(xù)濾液適量于2 mL離心管中，離心5分鐘，取上清液100 μL并用甲醇稀釋至1 mL，即得。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)譜庫的建立

將13種宣稱輔助降血糖類保健食品非法添加成分的名稱、分子式、精確相對分子質(zhì)量以及通過實(shí)驗(yàn)對 13種對照品測得的保留時(shí)間、碰撞能量、二級圖譜等信息導(dǎo)入 PDCL Manager（美國Agilent公司）軟件，建立13種非法添加成分標(biāo)準(zhǔn)譜庫，便于檢索和篩查。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

按照上述實(shí)驗(yàn)步驟，對方法的專屬性、線性范圍和檢出限、精密度、準(zhǔn)確度進(jìn)行全面考察，結(jié)果均符合要求。13種輔助降血糖類保健食品非法添加成分相關(guān)色譜、質(zhì)譜信息見表1。

3.1 檢出限

取13種對照品混標(biāo)溶液，分別稀釋進(jìn)樣，按信噪比S/N=3.0計(jì)算各化合物的檢出限。13種降血糖類藥物的檢出限見表2。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取 13種對照品混標(biāo)溶液，分別稀釋，配制成含13種降血糖類藥物各 0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。13種降血糖類藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2。根據(jù)擬合方程可知，r＞ 0.99，說明瑞格列奈在0.1～ 10 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，另12種降血糖類藥物在0.2～20 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

表2 13種降血糖類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

3.3 精密度

取 2 μg/mL的混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣 6次，按峰面積計(jì)算每種化合物RSD。樣品精密度測定結(jié)果見表2。由表可知，此實(shí)驗(yàn)條件的精密度＜3%，說明儀器精密度良好。

3.4 加樣回收率

取陰性樣品5份，平行添加10 μg/mL的混合對照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下處理，測定，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）加樣回收率在74.1%～90.0%之間，RSD在0.5% ～ 7.1%之間，具體見表2。說明該處理樣品的方法提取效率較高，方法準(zhǔn)確度較好。

4 樣品測定及結(jié)果

采用“2.4”項(xiàng)下處理并分析7批樣品，設(shè)置提取質(zhì)量窗口為精確相對分子質(zhì)量 ＜ 20 ppm，保留時(shí)間漂移＜0.1 min，根據(jù)保留時(shí)間、母離子、碎片離子、紫外光譜等信息綜合判斷，確定檢出化合物。結(jié)果表明，在7批樣品中，有1批檢出格列本脲，含量為735.0 μg/g。

5 討論

5.1 梯度洗脫條件的建立

由于磺酰脲類降血糖藥（如甲苯磺丁脲、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、格列齊特、格列喹酮、瑞格列奈）、雙胍類降血糖藥（如二甲雙胍、苯乙雙胍）和噻唑烷二酮類降血糖藥（如羅格列酮、吡格列酮）極性差異較大，故優(yōu)化梯度洗脫條件，將三類降血糖藥合并在同一個液相系統(tǒng)中，13個對照品可實(shí)現(xiàn)基本分離，峰形良好，專屬性強(qiáng)。

5.2 PCDL譜庫的規(guī)范建立

將13種降血糖類非法添加化學(xué)成分的名稱、分子式、精確相對分子質(zhì)量以及通過實(shí)驗(yàn)對13種對照品測得的保留時(shí)間、二級圖譜等信息導(dǎo)入PCDL manager軟件，形成譜庫，為以后的降血糖非法添加送檢保健食品的快速檢測提供了便利。

[1] 黃湘鷺，王靜文，曹進(jìn)，等.降血糖類保健食品中非法添加的8種藥物檢測及實(shí)例分析[J].食品科學(xué)，2014，35（10）：149-152.

[2] 羅疆南，曹玲，譚力，等.HPLC-MS/MS檢測中藥及保健品中添加的11種降糖類化學(xué)藥物[J].中國藥學(xué)雜志，2010，45（11）：68-70.

[3] 朱峰，阮麗萍，馬永建，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測降糖類和減肥類保健品中20種非法添加的化學(xué)降糖藥物[J].色譜，2014，32（1）：13-20.

[4] 肖樹雄，李楊杰.由降糖中成藥和保健食品檢驗(yàn)情況探索非法添加化學(xué)成分的系統(tǒng)快篩思路[J].藥物分析雜志，2011，31（2）：418-422.

[5] 魏清芳，王嘉林.液相色譜 -串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定中藥及保健品中非法添加 8種化學(xué)降糖藥[J].中國藥事，2011，25（1）：70-72.

Study on the Detection Method for Illegally Added Chemicals in Auxiliary Hypoglycemic Health Food

Wu Yang，Zhang Yuan，Min Chunyan，Hao Gang，Gu Bingren
（Suzhou Institute For Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215000，China）

Objective：To establish a fast，accurate and sensitive method for the detection of illegally added chemicals in auxiliary hypoglycemic health food by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS.The chemicals include metformin，buformin，phenformin，tolbutamide，gliclazide，pioglitazone，rosiglitazone，glibornuride，glipizide，repaglinide，glimepiride，glyburide and gliquidone.Methods：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18analysis column was adopted with a mobile phase of 0.01 mol/L ammonium acetate （containing 0.1%acetic acid）-methanol using gradient elution，and the flow rate was 0.3 mL/min.ESI＋scan and MS/MS mode were taken.Qualitative and quantitative analysis were carried out by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS.Results：The method was validated，a linear range was good（r＞0.99）with a precision of RSD ＜3%，the recovery was between 74.1% ～ 90.0%and the limit of detection was between 9.29 ～ 60.0 ng/mL，which can fully meet the screening requirements.Conclusion：This method is fast and accurate with a high sensitivity and a high degree of separation.It can be used for the screening and detection of illegally added chemicals in auxiliary hypoglycemic health food.

UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS；Auxiliary Hypoglycemic；Health Food；Illegally Added Chemicals

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.10.003

2014-08-19）

蘇州市科學(xué)技術(shù)局科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（SS201220）

吳楊，男，主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：973919367@qq.com

顧炳仁，男，碩士生導(dǎo)師，主任藥師。研究方向：藥物分析與管理。通訊作者E-mail：2803307338@qq.com