任 鵬 鄭吉龍 單 迪

（中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035）

應(yīng)用免疫熒光技術(shù)推斷皮膚燙傷時間

任 鵬 鄭吉龍 單 迪

（中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035）

制作小鼠皮膚燙傷模型，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)分別對小鼠皮膚燙傷后不同時間標記MPO、F4/80及α-SMA，以此統(tǒng)計中性粒細胞、巨噬細胞及肌成纖維細胞的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)綜合此3種細胞表達時序性變化可更加準確推斷皮膚燙傷時間，與HE染色結(jié)果比較，免疫熒光技術(shù)更加敏感可靠。

免疫熒光染色 皮膚燙傷 MPO F4/80 α-SMA

1 材料與方法

1.1 小鼠皮膚燙傷模型制作與分組

健康成年昆明系SPF級小鼠35只，雌雄不限，體質(zhì)量25g～35g，隨機分為7組，其中1個對照組，6個燙傷組，每組5只。小鼠背部皮膚備皮，戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔麻醉后，將小鼠四肢伸展俯臥狀固定。室溫下（20℃～24℃），使沸水與燙傷組小鼠皮膚持續(xù)接觸10s，接觸面積（燙傷面積）為直徑1cm圓形。燙傷后小鼠不給予任何處理實驗條件下，分籠飼養(yǎng)并分別于傷后1d、3d、5d、7d、10d及14d乙醚麻醉處死，以背部燙傷區(qū)為中心取材2cm×2cm皮膚，用4%多聚甲醛中性液固定后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制作5μm石蠟切片。

1.2 免疫熒光染色

常規(guī)脫蠟、脫苯、水化；5%BSA封閉1h；滴加用抗體稀釋液稀釋的兔抗小鼠MPO（1∶200）、大鼠抗小鼠F4/80（1∶200）、兔抗小鼠α-SMA（1∶200）IgG多克隆抗體，保濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；滴加FITC標記的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488-山羊抗大鼠IgG二抗，室溫下保濕盒內(nèi)避光孵育2h；滴加Hoechst33258，室溫下避光保濕盒內(nèi)3min；滴加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察；染色過程中以PBS替代一抗作為陰性對照，常規(guī)做HE染色。

1.3 陽性細胞計數(shù)分析

普通光學(xué)顯微鏡×400下，燙傷區(qū)及燙傷周邊區(qū)每張切片中隨機選擇10個視野，分別計數(shù)中性粒細胞及巨噬細胞的細胞總數(shù)，并計算這兩種細胞占視野內(nèi)細胞總數(shù)的百分比。熒光顯微鏡×400下，燙傷區(qū)及燙傷周邊區(qū)每張切片中隨機選擇10個視野，分別計數(shù)MPO+細胞、F4/80+細胞及α-SMA+細胞的細胞總數(shù)，并計算這三種細胞占視野內(nèi)細胞總數(shù)的百分比。采用SPSS13.0 for Windows軟件，計量資料用均數(shù)±標準差（X±s）表示，進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 燙傷宏觀所見

小鼠皮膚燙傷后局部皮膚呈淡紅色，無紅斑及水泡，切開內(nèi)面觀可見水腫、充血，背部肌肉未見損傷。傷后1d，燙傷區(qū)界限清晰，表面干燥；傷后3d，創(chuàng)緣皮膚收縮，界限清晰；傷后5d～7d，痂皮形成，表面淡棕黃色，燙傷區(qū)域縮??；傷后10d，燙傷區(qū)痂皮開始脫落，燙傷區(qū)明顯縮??；傷后14d燙傷區(qū)痂皮大部分脫落，燙傷區(qū)進一步縮小。

2.2 HE染色

經(jīng)常規(guī)HE染色，傷后1d，可見大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主；傷后3d，損傷周邊上皮角形成明顯，巨噬細胞增多；傷后5d，可見梭形成纖維細胞和大量巨噬細胞，可見較明顯肉芽組織；傷后7d，肉芽組織內(nèi)可見梭形成纖維細胞和新生毛細血管；傷后10d～14d，見大量梭形成纖維細胞，間質(zhì)增多，毛囊增多。HE染色后中性粒細胞和巨噬細胞統(tǒng)計學(xué)分析參見表1。

表1 燙傷后各時間段的HE染色中性粒細胞和巨噬細胞百分率

2.3 燙傷區(qū)及周邊區(qū)MPO+細胞、F4/80+細胞、α-SMA+細胞表達

MPO+主要在多型核粒細胞中表達，皮膚燙傷1d～7d，MPO+細胞表達逐漸減低，傷后10d～14d，MPO+細胞消失，1d MPO+細胞表達高峰。F4/80+主要在單個核細胞中表達，皮膚燙傷1d～5d，F(xiàn)4/80+細胞逐漸增高，傷后7d～14d，F(xiàn)4/80+細胞表達逐漸減低，5d F4/80+細胞表達高峰。α-SMA+主要在單個核長梭形細胞中表達，傷后1d，未見α-SMA+細胞，3d～14d α-SMA+細胞表達逐漸增高，14d α-SMA+細胞表達高峰。小鼠皮膚燙傷后各時間段的MPO+細胞、F4/80+細胞、α-SMA+細胞百分率見圖，統(tǒng)計學(xué)分析見表2。

圖 燙傷后各時間段的MPO+細胞、F4/80+細胞、α-SMA+細胞百分率

表2 燙傷后各時間段的熒光染色MPO+細胞、F4/80+細胞、α-SMA+細胞百分率

2.4 細胞計數(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析

表1為HE染色下中性粒細胞陽性細胞和巨噬細胞計數(shù)百分率，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各相鄰兩組之間中性粒細胞細胞和巨噬細胞計數(shù)百分率有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。表2為免疫熒光技術(shù)染色下MPO+細胞、F4/80+細胞、α-SMA+細胞百分率，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各相鄰兩組之間MPO+細胞、F4/80+細胞、α-SMA+細胞百分率有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討論

皮膚燙傷是法醫(yī)學(xué)中經(jīng)常遇到的損傷，燙傷時間推斷也是法醫(yī)學(xué)工作難點。皮膚燙傷愈合是一個連續(xù)而又復(fù)雜的生理過程，和通常皮膚損傷一樣大致可分為三個階段：急性滲出期、纖維增生期和組織重建期。在急性滲出期，各種類型的炎癥細胞，例如中性粒細胞和巨噬細胞，浸潤到損傷區(qū)域參與清除損傷壞死組織、異物及入侵的病原體等。在纖維增生期，肌成纖維細胞主要參與損傷組織的修復(fù)。本文制作小鼠皮膚深Ⅱ°燙傷模型，觀察發(fā)現(xiàn)早期小鼠皮膚全層燙傷，組織疏松，內(nèi)面紅腫。鏡下?lián)p傷早期可見炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞為主，并可見少量巨噬細胞。隨著損傷時間的延長，可見中性粒細胞逐漸減少，巨噬細胞逐漸增多，并開始出現(xiàn)肌成纖維細胞和成纖維細胞并且數(shù)量逐漸增加；隨著皮膚愈合過程的進一步延長，肌成纖維細胞和成纖維細胞開始逐漸減少，膠原纖維開始形成，肉芽組織向瘢痕組織轉(zhuǎn)變。

本研究采用免疫熒光技術(shù)對中性粒細胞、巨噬細胞和肌成纖維細胞標記，把這3種細胞在皮膚燙傷愈合過程中時序性表達情況統(tǒng)計分析。免疫熒光技術(shù)基本原理是抗原抗體反應(yīng)，對某種特定細胞抗原給予相匹配的抗體，由于抗原抗體之間存在高度特異性，當(dāng)抗原出現(xiàn)數(shù)量或位置變化時，抗體也會出現(xiàn)相應(yīng)的變化，將熒光素標記在抗體上，在熒光顯微鏡下觀察就會出現(xiàn)特異性的熒光。免疫熒光技術(shù)優(yōu)點在于敏感度高，比較免疫組織化學(xué)技術(shù)來看，雖同為抗原抗體反應(yīng)，但其熒光的敏感度遠遠大于免疫組化的生物素標記。特異性好，利用抗原抗體反應(yīng)高度特異性，在觀察某種特定細胞時，只要標記該細胞的特異性抗原就可以辨別，這一點是HE染色、Masson染色等噬色性染色所無法比擬的。比較分析HE染色和免疫熒光技術(shù)對中性粒細胞呈現(xiàn)情況來看，燙傷早期1d和3dHE染色計數(shù)中性粒細胞數(shù)量要低于免疫熒光技術(shù)計數(shù)數(shù)量，這可能由于炎癥早期中性粒細胞多以2～3分葉核細胞為主，在HE染色下比較難以鑒別為中性粒細胞，從而被漏計數(shù)；而免疫熒光技術(shù)摒棄了這個缺點，只要存在MPO陽性就為中性粒細胞，大大提高了敏感度和特異性。燙傷中期5d和7dHE染色計數(shù)中性粒細胞數(shù)量和免疫熒光技術(shù)計數(shù)數(shù)量基本相同，這可能是由于HE染色中一些裸核中性粒細胞也被計數(shù)其中，裸核中性粒細胞是“死亡”的中性粒細胞沒有計數(shù)意義，而在免疫熒光技術(shù)計數(shù)中裸核中性粒細胞無免疫熒光表達而不被計數(shù)，此階段HE染色計數(shù)中性粒細胞數(shù)量和免疫熒光技術(shù)計數(shù)數(shù)量雖基本一致，但HE染色中把一些死亡中性粒細胞也包括在內(nèi)，這是一種偽敏感度提高。比較分析HE染色和免疫熒光技術(shù)對巨噬細胞呈現(xiàn)情況來看，HE染色中，巨噬細胞表現(xiàn)為細胞較圓較大，核圓大居中，而在免疫熒光技術(shù)F4/80陽性的為巨噬細胞，通過多人對2種染色技術(shù)中巨噬細胞數(shù)量計數(shù)，對比兩者數(shù)據(jù)來看，HE染色計數(shù)數(shù)據(jù)的標準差明顯高于免疫熒光技術(shù)計數(shù)數(shù)據(jù)的標準差，這一點說明免疫熒光技術(shù)具有更高的準確性和易辨別性，大大降低不同人對巨噬細胞計數(shù)的誤差。比較分析HE染色和免疫熒光技術(shù)對肌成纖維細胞呈現(xiàn)情況來看，HE染色基本無法確認肌成纖維細胞，α-SMA陽性是肌成纖維細胞，通過免疫熒光技術(shù)檢測肌成纖維細胞的優(yōu)勢是不言而喻的。

本實驗表明，MPO陽性率燙傷愈合過程與時間呈負相關(guān)，隨著燙傷時間延長其陽性率逐漸下降以至消失，1d表達高峰。F4/80陽性率在燙傷愈合過程中，隨著燙傷時間延長呈單峰狀分布，5d表達高峰。α-SMA陽性率燙傷過程中呈正相關(guān)，隨著燙傷時間延長其陽性率逐漸上升，14d表達高峰。皮膚燙傷1d MPO陽性率＞50%，F(xiàn)4/80陽性率＜5%，無α-SMA表達；皮膚燙傷3d MPO陽性率≈50%，F(xiàn)4/80陽性率和α-SMA陽性率均＜5%；皮膚燙傷5d MPO陽性率、F4/80陽性率及α-SMA陽性率三者均＜30%；皮膚燙傷7d MPO陽性率＜15%，F(xiàn)4/80陽性率＜25%，α-SMA陽性率＞40%；皮膚燙傷10d無MPO表達，F(xiàn)4/80陽性率＜20%，α-SMA陽性率≈50%；皮膚燙傷14d無MPO表達，F(xiàn)4/80陽性率＜10%，α-SMA陽性率＞60%。通過以上數(shù)據(jù)綜合判斷皮膚燙傷時間具有很高準確性。

4 小結(jié)

皮膚燙傷時間推斷是國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)研究的空白領(lǐng)域。本實驗通過免疫熒光技術(shù)檢測皮膚燙傷愈合過程中急性期、增生期和重建期三種主要的細胞，通過對其陽性率統(tǒng)計和與普通HE染色比較，發(fā)現(xiàn)可以大幅度提高燙傷時間推斷準確性，檢測方法特異性敏感性都顯著高于以往方法。

[1]KubiliusD，Smailyte G，Rimdeikiene I，et al. Epidemiology of paediatric burnsin Lithuania:Focus on a vulnerable population exposed to the risk ofscaldsat home withouthottapwatersupply[J].Burns，2013，(13).

[2]任鵬，官大威，趙銳，等.小鼠皮膚燙傷模型的建立[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2012，28(2).

[3]FrodlundM，DahlstromO，KastbomA，.etal. Associationsbetween antinuclear antibodystainingpatterns andclinicalfeaturesofsystemiclupuserythematosus:analysis ofaregionalSwedishregister[J].BMJOpen，2013，3(10).

[4]Waugh N,CumminsE，Royle P，et al.Faecal calprotectintestingfordifferentiatingamongstinflammatory and non-inflammatory bowel diseases:systematic review andeconomicevaluation[J].HealthTechnolAssess，2013，17(55).

[5]Khalatbary AR， Ahmadvand H.Effect of oleuropein on tissue myeloperoxidase activity in experimental spinal cord trauma[J].Iran Biomed J，2011，15(4).

[6]Kurashige C，Hosono K,Matsuda H，et al. Roles of receptoractivity-modifying protein 1 in angiogenesis and lymphangiogenesis during skin wound healingin mice[J].FASEBJ，2013，（5）.

[7]Serrat N，Sebastian C，Pereira-LopesS，et al. The Response of Secondary Genesto Lipopolysaccharides in Macrophages Depends on Histone Deacetylase and PhosphorylationofC/EBPβ[J].JImmunol，2013，（4）.

[8]PillaiMM，HayesB，Torok-StorbB.Inducible transgenes under the control of the hCD68 promoter identifiesmousemacrophageswith adistribution that differs from the F4/80-and CSF-1R-expressingpopulations[J]. ExpHematol，2009，37(12).

[9]Park HH，Park IH，Cho JS，et al.The effect ofmacrolideson myofibroblast differentiation and collagen production in nasal polyp-derived fibroblasts[J].Am J RhinolAllergy，2010，24(5).

[10]VanheuleE，GeertsAM,VanHuysseJ，etal.An intravitalmicroscopicstudyofthehepaticmicrocirculationin cirrhotic mice models：relationship between fibrosis and angiogenesis[J].IntJExpPathol，2008，89(6).

（責(zé)任編輯：于 萍）

DF795.4

A

2014-01-05

公安部重點攻關(guān)計劃項目（編號：2011ZDYJXJXY005）；遼寧省博士啟動基金項目（編號：20141048）。

任鵬（1985-），男，遼寧錦州人，中國刑警學(xué)院法醫(yī)系助教，碩士，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。