林勤，余之煥

（1.湖北省黃石市中心醫(yī)院普愛病區(qū)，湖北 黃石 435000； 2.湖北省黃石市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 黃石 435000）

復(fù)方五倍子熏洗液（鄂藥制字Z20070439）是我院老中醫(yī)根 據(jù)幾十年臨床經(jīng)驗(yàn)擬訂的協(xié)定處方，對(duì)痔瘡的治療及其各種癥狀緩解效果較好。為保證臨床療效，根據(jù)生產(chǎn)工藝，對(duì)復(fù)方五倍子熏洗液的質(zhì)量進(jìn)行控制。以沒食子酸為對(duì)照品，按2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄中薄層色譜法試驗(yàn)，對(duì)復(fù)方五倍子熏洗液進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定五倍子中主要化學(xué)成分鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物沒食子酸的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－10A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SPD－10A型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；色譜柱為HypersilBDSC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；Sartorius BT 25S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。五倍子、桑寄生、撲硝、蓮房、枯凡均購(gòu)自湖北省黃石市藥材公司；沒食子酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110831－200302）；硅膠GF254薄層G板（青島海洋化工廠）；自制復(fù)方五倍子熏洗液 3批（批號(hào)分別為 20100516，20100522，20100525）；甲醇、鹽酸、三氯甲烷、甲酸乙酯、甲酸等試劑均為化學(xué)純，純化水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方及制備工藝

處方：五倍子 30 g，桑寄生 30 g，撲硝 30 g，蓮房 30 g，枯凡 9 g。

制備：將處方量五倍子、桑寄生、撲硝、蓮房、枯凡分別粉碎，過四號(hào)篩，加純化水適量，浸泡30 min后，文火煎煮20 min，過濾；藥渣再加純化水適量，用文火煎煮15min，過濾，合并濾液，濃縮，調(diào)節(jié)總量至1 000mL，即得復(fù)方五倍子熏洗液。

2.2 定性鑒別

取復(fù)方五倍子熏洗液適量，水浴蒸干，加甲醇5 mL，超聲處理15min，濾過，濾液中加入4mol／L鹽酸適量，繼續(xù)水浴加熱水解3.5 h，放冷，作為供試品溶液。另取缺五倍子陰性樣品適量，同法制成陰性對(duì)照品溶液。取沒食子酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含1mg的沒食子酸溶液，作為對(duì)照品溶液。按2010年版《中國(guó)藥典 （一部 ）》附錄薄層色譜法試驗(yàn)［1］，吸取上述3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷－甲酸乙酯－甲酸（5 ∶5 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果在供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾，見圖1。

圖1 薄層色譜圖

2.3 沒食子酸含量測(cè)定

2.3.1 溶液制備

精密稱取沒食子酸對(duì)照品100mg，置100mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解，制成1 g／L沒食子酸對(duì)照品貯備液。精密量取復(fù)方五倍子熏洗液5mL，置100mL燒杯中，水浴蒸干；加入4mol／L鹽酸適量，繼續(xù)水浴，加熱水解3.5 h，放冷，定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用4 mol／L鹽酸調(diào)節(jié)至刻度，濾過；精密量取續(xù)濾液2mL，置25mL棕色容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按復(fù)方五倍子熏洗液制備方法制備不含五倍子的熏洗液，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：甲醇－0.1% 磷酸溶液（15 ∶85）；柱溫：30 ℃ ；流速：1.0mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm；進(jìn)樣最：20μL。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液在保留時(shí)間為8.198 min處有很好的吸收峰，陰性對(duì)照品溶液無干擾，見圖2，分離度大于1.5，理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3500。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取沒食子酸對(duì)照品貯備液適量，分別置25 mL棕色容量瓶中，得1～5號(hào)對(duì)照品溶液，各加入50%甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為20，40，60，80，100 μg ／mL 的系列對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝142.96X＋0.0824，r＝0.9996（n＝5）。結(jié)果表明，沒食子酸進(jìn)樣量在 20.0～100.0μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

陰性干擾試驗(yàn)：分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各20μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液在與沒食子酸對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處未出現(xiàn)干擾色譜峰，故本法適合復(fù)方五倍子熏洗液中的沒食子酸的含量測(cè)定，見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密量取沒食子酸對(duì)照品貯備液適量，用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為60μg／mL的溶液，取20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果的RSD為0.63%（n＝6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取同一供試品溶液，放置，分別于0，1，2，4，6，8 h時(shí)依法測(cè)定。結(jié)果的RSD為 1.13% （n＝6），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取同一批（批號(hào)為20100516）復(fù)方五倍子熏洗液6份，分別按供試品溶液制備方法制備溶液，依法連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為1.57%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取同一批（批號(hào)為20100516）復(fù)方五倍子熏洗液9份，每份2.5 mL，分別置100 mL燒杯中，分成3組，每組3份；精密稱取沒食子酸對(duì)照品60，75，90mg各3份，分別加入3組樣品液中，按供試品溶液制備方法制成100mL的溶液；精密量取續(xù)濾液2 mL，置25mL棕色容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻。依法進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 沒食子酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.3.4 樣品含量測(cè)定

分別取 3批樣品（批號(hào)分別為 20100516，20100522，20100525）各5mL，依法制備供試品溶液，分別取20μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，依法計(jì)算含量。結(jié)果3批樣品中鞣質(zhì)按沒食子酸含量計(jì)分別為1.26%，1.21%，1.29%。

3 討論

痔瘡的病因較復(fù)雜，《外科正宗》曰：“夫痔者及素積濕熱過食炙輔或因久坐而血脈不行，又因七情而過傷生冷，以及擔(dān)輕負(fù)重，竭力之行，氣血縱橫經(jīng)絡(luò)交錯(cuò)，又或酒色過度，腸胃受傷，以致濁氣瘀血流注肛門，俱能發(fā)痔?！薄夺t(yī)宗金鑒》曰：“痔瘡開絡(luò)亦多般，不外風(fēng)濕燥熱源……。”臨床上常采用熏洗及外抹藥物治療痔瘡急性期。筆者設(shè)計(jì)了復(fù)方五倍子熏洗液，方中五倍子、蓮房、枯凡有收斂固澀、止血、消腫、止痛之功效。方中五倍子為君藥，臣藥為蓮房、枯凡，佐以桑寄生扶正撲硝消腫排毒。本方采用純中藥制劑制成外洗液，使藥物直接作用于患病部位，針對(duì)性強(qiáng)，藥物吸收迅速，具有清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛、生津收口的功效。

有關(guān)中藥中鞣質(zhì)含量測(cè)定方法已有報(bào)道，賈蘭秀等［2］采用重量法，但復(fù)方中藥制劑干擾因素多；朱瓊等［3］用紫外分光光度法，但顯色不穩(wěn)定，誤差大。參考文獻(xiàn)［4－5］，本試驗(yàn)中復(fù)方五倍子熏洗液的質(zhì)量控制采用2010年版《中國(guó)藥典（一部）》中的方法，將鞣質(zhì)水解生成沒食子酸測(cè)定含量，結(jié)果沒食子酸吸收峰與復(fù)方五倍子熏洗液中其他成分分離效果很好，方法可行，結(jié)果準(zhǔn)確，表明測(cè)定沒食子酸含量可更客觀地控制復(fù)方五倍子熏洗液的質(zhì)量。

復(fù)方五倍子熏洗液中五倍子為君藥，鞣質(zhì)是五倍子中的主要有效成分，故選用鞣質(zhì)作為質(zhì)量控制指標(biāo)成分可有效保證其質(zhì)量。2010年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定，五倍子含鞣質(zhì)以水解的沒食子酸（C7H6O5）計(jì)不得少于50.0%［1］。復(fù)方五倍子熏洗液中五倍子含量為3%，即含鞣質(zhì)以水解的沒食子酸計(jì)算理論含量應(yīng)為1.5%，實(shí)際3批樣品含量測(cè)定結(jié)果按沒食子酸計(jì)算平均為1.25%，即提取率為83.33%?？梢?，今后應(yīng)從原料藥材及制備工藝等方面把關(guān)，以進(jìn)一步提高復(fù)方五倍子熏洗液的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

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［3］朱 瓊，包貝華，曹雨誕，等.雞冠花炭飲片中鞣質(zhì)的含量測(cè)定［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（1）：62 －64.

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