吳 英 ，鄭 直 ，白 雪 ，楊思進(jìn) ，黃帥金

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院，四川 瀘州 646000； 2.瀘州市人民醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

腦梗死因高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率而成為嚴(yán)重威脅人 類生命健康的重大疾病之一，其預(yù)后與病灶微循環(huán)的改善及神經(jīng)組織修復(fù)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，新形成的側(cè)支血管可改善缺血區(qū)周圍組織灌流，促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)［1］。因此，通過(guò)血管新生啟動(dòng)損傷區(qū)微血管網(wǎng)重建是腦組織修復(fù)的重要過(guò)程。蛭龍活血通瘀膠囊由黃芪、水蛭、地龍、大血藤等組方，具有益氣、活血化瘀通絡(luò)、祛風(fēng)的功效。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，蛭龍活血通瘀膠囊能明顯促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與促進(jìn)缺血腦組織促血管生成素 －1（Ang－1）、酪氨酸激酶 －2（Tie－2）表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試藥與動(dòng)物

Ang－1兔抗鼠多克隆抗體（北京四正柏生物科技有限公司，批號(hào)為110601）；Tie－2兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為YE1030W）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京四正柏生物科技有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）。蛭龍活血通瘀膠囊（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院制劑室，批號(hào)為20121212）；步長(zhǎng)腦心通膠囊（咸陽(yáng)步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)為120995）。健康雄性SD大鼠150只，體重250～300 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)為SYXK（川2008－065），于室溫普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組

參照 Longa等［2－4］報(bào)道的線栓改良法造大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）動(dòng)物模型，造模動(dòng)物自然蘇醒后，參照Z(yǔ)ealonga評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［2］進(jìn)行5分制評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀，0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，1分；向外側(cè)轉(zhuǎn)圈，2分；行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒，3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)昏迷，4分。將術(shù)后24 h評(píng)分為1～3分的大鼠選入組，剔除其余動(dòng)物，作隨機(jī)補(bǔ)充。用隨機(jī)數(shù)字表法將120只造模大鼠分為6組，即蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組，步長(zhǎng)腦心通膠囊對(duì)照組，模型組，假手術(shù)組。

1.2.2 藥物干預(yù)

蛭龍活血通瘀膠囊成人（體重按60 kg計(jì)算）的臨床用藥量為 4.8 g ／d，按人體用量的 5，10，20 倍，換算動(dòng)物低、中、高劑量組的用藥量分別為0.4，0.8，1.6 g／kg；腦心通組按成人用量的10倍給藥，即0.8 g／kg。各藥物干預(yù)組均給予等體積（3mL）相應(yīng)濃度的藥物灌胃，假手術(shù)組及模型組給予等體積（3mL）的生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)7 d，并按體重調(diào)整給藥量。

1.2.3 指標(biāo)采集及檢測(cè)方法

神經(jīng)功能缺損評(píng)分：各組大鼠灌胃7 d后，依照Z(yǔ)ealonga5分制評(píng)分方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，判斷各組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。

免疫組化標(biāo)本制備及檢測(cè)：腦缺血7 d后，各組大鼠以4%多聚甲醛進(jìn)行腦組織固定后，SP法Ang－1及Tie－2免疫組化染色，DAB顯色。任何被Ang－1及Tie－2抗體染成棕黃色或棕褐色的細(xì)胞均視為陽(yáng)性表達(dá)。

計(jì)算機(jī)圖像分析：采用Image－Pro－Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，每只大鼠隨機(jī)選取3張切片，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（被染成棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞），每組所有照片的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)代表該組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析（OneWay Aonva），兩兩對(duì)比采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

結(jié)果見表1?？梢姡c假手術(shù)組比較，模型組及給藥各組大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能缺損評(píng)分均升高。與模型組比較，活血通瘀膠囊高、中、低劑量組神經(jīng)功能缺損癥狀均明顯改善，以高劑量組尤為明顯。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（ ± s，n＝20）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（ ± s，n＝20）

注：與假手術(shù)組比較，★P＜0.05，▲P＜0.01；與模型組比較，●P＜0.05，◆P＜0.01；與蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組比較，◎P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組蛭龍活血通瘀膠囊中劑量組蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組步長(zhǎng)腦心通對(duì)照組劑量（g／kg）001.60.80.40.8神經(jīng)體征評(píng)分（分）02.98±0.98▲2.49±0.83★●2.15 ±0.87★◆◎1.94 ±0.53★◆◎2.01 ±0.74★◆◎

2.2 腦組織Ang－1及Tie－2陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

結(jié)果見圖1、圖2及表2?？梢?，Ang－1及Tie－2在假手術(shù)組腦組織血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)量極少。模型組大鼠腦缺血區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)較假手術(shù)組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。蛭龍高、中、低劑量組大鼠腦缺血皮層神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，均強(qiáng)于模型組（P＜0.01或P＜0.05），以高劑量組尤為顯著。

圖1 大鼠腦組織Ang－1的表達(dá)圖像（×400）

3 討論

圖2 大鼠腦組織Tie－2表達(dá)（×400）

表2 各組大鼠腦組織Ang－1及Tie－2表達(dá)比較（ ± s，n＝20）

表2 各組大鼠腦組織Ang－1及Tie－2表達(dá)比較（ ± s，n＝20）

注：與假手術(shù)組比較，▲P＜0.05，◆P＜0.01；與模型組比較，●P＜0.05，■P＜0.01；與蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組比較，★P＜0.05。

T i e－2組別 劑量（g／k g）A n g－14.06±1.017.87±0.73▲9.84±0.60◆●13.15±1.06◆■★13.47±0.99◆■★13.12±0.66◆■★假手術(shù)組模型組蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組蛭龍活血通瘀膠囊中劑量組蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組步長(zhǎng)腦心通對(duì)照組0 00.40.81.60.84.47±1.3811.89±0.71▲13.88±1.37◆●19.01±0.59◆■★20.30±0.27◆■★19.48±0.58◆■★

Ang－1是一族特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，含免疫球蛋白樣環(huán)和上皮生長(zhǎng)因子樣域Tie－2。Tie－2為Ang－1內(nèi)皮特異性酪氨酸激酶受體，Ang－1以旁分泌形式與Tie－2受體結(jié)合，觸發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管周細(xì)胞相互作用，促進(jìn)血管穩(wěn)定和成熟，并維持成熟血管的完整性及靜息狀態(tài)［5］。在對(duì)腦卒中的研究中發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧可誘導(dǎo)Ang－1／Tie－2的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腦損傷區(qū)微血管新生過(guò)程［6］。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血－再灌注后Ang－1表達(dá)增加，與Tie－2結(jié)合，可抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［7］，減輕血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）產(chǎn)生的血管通透作用，減少腦缺血后血腦屏障的滲漏，降低腦水腫的程度［8］。Ang－1除了促進(jìn)腦缺血后血管新生，還可保護(hù)神經(jīng)元、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡并刺激神經(jīng)發(fā)生［9］。其機(jī)制可能為Ang－1促使PI－3激酶活化和激活絲氨酸－蘇氨酸蛋白酶，抑制胞漿內(nèi)特異性識(shí)別天冬氨酸位點(diǎn)蛋白 － 3（Caspase －3）裂解，干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［10］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，蛭龍活血通瘀膠囊高、中、低劑量組大鼠Ang－1及 Tie－2表達(dá)明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），表明蛭龍活血通瘀膠囊可能通過(guò)促進(jìn)腦缺血區(qū)Ang－1及Tie－2表達(dá)，促進(jìn)缺血區(qū)形成穩(wěn)定的成熟血管網(wǎng)，修復(fù)神經(jīng)損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

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