張 寶 ，李世龍 ，葛保民 ，秦 莉 ，田珊紅 ，周秀艷 ，李 霞

（1.河北省唐山市傳染病醫(yī)院，河北 唐山 063000； 2.河北省唐山市人民醫(yī)院，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山 063000）

目前，大多數乙型肝炎病毒（HBV）基因型研究的重點是A－F基因型。HBV的P區(qū)可編碼DNA復制所需的末端蛋白，而且參與了病毒復制的全過程，始于約2500 bp，C區(qū)與開始區(qū)段重疊，中間區(qū)段與S區(qū)重疊，最后片段與X區(qū)重疊。研究認為，HBV對核苷類似藥物耐藥性的產生與HBV P基因多位點的變異有關。本研究中采用毛細管電泳直接測序技術檢測了HBV基因型A－F及HBV P 區(qū)的 rtV173L，rtL180M，rtA181V ／T ／S，rtT184A ／G ／I／S，rtS202G ／I，rtM204V ／I，rtV207I／L ／G，rtS213T，rtV214A，rtQ215S，rtN236T，rtP237H，rtN238T ／D，rtM250V ／I位點突變情況并進行分析。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源、試劑及儀器

樣本為2010年至2012年河北省唐山市傳染病醫(yī)院門診和住院部239例需要抗病毒治療的慢性乙型病毒性肝炎患者。其中男195例，年齡18～77歲，平均44.48歲；女44例，年齡20～63歲，平均 41.29歲；HBV－DNA均呈陽性，且 HBV－DNA≥104拷貝／mL；診斷符合《乙型肝炎防治指南》中的診斷標準。HBV及耐藥突變檢測試劑盒（核酸擴增熒光定量及測序法），購自上海申友生物技術有限責任公司。ABI 310型系列PCR熒光檢測儀；Sequencing Analysis5.2軟件。

1.2 方法

采用核酸擴增技術結合熒光標記探針雜交方法，對HBV－DNA進行定量檢測。對定量檢測HBV－DNA≥5×103拷貝／mL的樣本，取其PCR產物3μL，再加入2μL蝦堿性磷酸酶（SAP）的混合物，混勻，37℃ 60 min，80℃ 15 min，最后于 4℃保存。取陽性PCR酶解產物3μL、測序試劑（bigdye）1μL和測序產物2μL進行PCR擴增，DNA測序產物經一系列步驟純化后上機電泳，在自動化的ABI310型基因分析儀上進行測序。

1.3 統計學處理

收集整理原始數據錄入計算機，采用SPSS 17.0統計軟件進行處理。

2 結果

在使用抗病毒藥物的239例患者中，利用毛細管電泳法檢測到B基因型HBV感染者30例（12.55%），C基因型HBV感染者203例（84.94%）；D基因型 HBV感染者 1例（0.42% ），5例（20.%）HBV感染者低于最低檢測限?？梢姡窘M患者HBV基因型主要是C型和B型，這一結果與謝秀琴等［1］的研究結果相似。D基因型是在我國北方地區(qū)較少發(fā)現的基因型。但本研究中未檢出B和C混合型的基因型，這可能與病例數少或存在地區(qū)性差異有關，有待進一步跟蹤。239例患者HBV耐藥性情況見表1。

3 討論

目前全球約1／3的人曾感染過HBV，其中有3.6億人發(fā)展為慢性乙型病毒性肝炎，我國約有慢性HBV感染者1.3億人，且每年死于HBV持續(xù)感染相關疾病［2］，包括肝細胞癌（HCC）的至少有100萬人，最值得關注的是慢性HBV持續(xù)感染會發(fā)展為肝硬化、肝癌，嚴重威脅著人類的健康。國內外公認的抗HBV藥物主要有干擾素和核苷（酸）類似物兩大類，常用的核苷（酸）類似藥物有拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定和恩替卡韋等，它們通過抑制HBV復制而在治療過程中促使乙型肝炎e抗原（HBeAg）的血清學轉換，并最終清除病毒，從而控制病情的進展。對于慢性抗HBV感染者，HBV治療需要長期用藥，通常情況下至少需要2年，若未經專科醫(yī)生同意，在病情緩解不穩(wěn)固的情況下停藥，不僅不能抑制病毒，還可能加速病毒耐藥的發(fā)生，甚至使病毒的復制反彈，導致病情加重。臨床研究表明，拉米夫定治療1，2，3，4年的基因耐藥率分別為14%，38%，49%，66%；阿德福韋酯治療1，2，3，4，5年的基因耐藥率為0，3%，11%，18%，29%；在拉米夫定治療失敗的患者中，恩替卡韋治療1，2，3年的基因耐藥率為6%，14%，32%，其中伴有病毒反彈的臨床耐藥率分別為1%，10%，25%［3－4］。因此，在用藥過程中及時檢測病毒耐藥情況，有利于臨床及時調整用藥方案，控制病情進一步發(fā)展。

表1 239例患者血清樣本HBV耐藥情況

HBV有較高的突變率和復制率，高度易突變性體現在，其DNA多聚酶在DNA復制過程的逆轉錄環(huán)節(jié)缺失校正活性，且HBV的各個基因區(qū)及多數調控元件都可能發(fā)生變異。另外，某些位點的變異可影響多個基因片段，原因就在于HBV基因存在基因重疊，變異病毒株可改變免疫原性和致病性，引起宿主免疫應答的相應變化，導致病情加重并趨復雜化，甚至惡性化成重癥肝炎；而且在長期HBV感染過程中HBV發(fā)生變異，會引起病毒DNA與宿主DNA發(fā)生整合，誘導肝癌的發(fā)生。

有文獻報道，拉米夫定變異的多為YMDD花式區(qū)域的rtM204V／I，而本研究檢測出拉米夫定主要的變異除rtM204V／I外，還有 rtL180M 變異及 rtV173L變異和 rtV207I／L／G，rtS213T變異，與 Aye 等［5］和 Hussain 等［6］的報道有一致性，大大提高了耐藥檢出率。這也提示rtV173L突變伴隨M180＋M204出現可能與拉米夫定耐藥相關，驗證了William等［7］的報道。本研究中共檢出對拉米夫定耐藥的患者101例，占42.26%，其中8例拉米夫定耐藥血清中同時有3例對替比夫定耐藥，為單獨rtM204I／V／S變異所致；檢出對阿德福韋酯耐藥43例，占17.99%，耐藥率明顯低于拉米夫定，主要是 rtN236T，rtA181V ／I／S，rtN ／H238T ／D位點變異，并有1例rtV214A變異，1例rtN236T野生和突變共存株，1例rtQ215S野生和突變共存株，2例rtP237H野生和突變共存株；目前發(fā)現的恩替卡韋耐藥突變大多發(fā)生于拉米夫定耐藥的患者，主要由 rtM250V ／L，rtT184A ／G ／I／S，rtS202G ／I結合rtM204I／V／S＋rtL180M突變組成。另外，隨著抗病毒藥物的長期應用，有35.56%的患者出現了拉米夫定、替比夫定和恩替卡韋共同耐藥，甚至已有3.35%的患者出現了拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定和恩替卡韋4種抗病毒藥共同耐藥的情況，這明顯加大了治療難度。

HBV各基因型之間存在著致病性和治療應答方面的差異?？赡芘cC基因型預后不良有關的是：B和C基因型之間的差異性體現在慢性乙型病毒性肝炎B＋C及C基因型患者經拉米夫定治療后HBV－DNA陰轉率、HBeAg血清轉換率及ALT復常率均顯著高于B型慢性乙型病毒性肝炎患者［8］，并且C基因型與炎癥壞死及肝纖維化的關系更為密切，更易引起更嚴重的肝臟疾病如肝硬化和肝細胞癌；在年齡大于30歲的感染者中，尤為明顯的是Ba亞型患者的HBeAg陽性率顯著高于Bj亞型，后者發(fā)生肝細胞癌的年齡顯著高于前者。對于拉米夫定耐藥變異的慢性乙型病毒性肝炎患者，YIDD變異主要發(fā)生于C基因型，B基因型多發(fā)生YVDD變異，且變異后的B基因型的HBV復制水平比C基因型要低，B基因型、C基因型拉米夫定耐藥的HBV病毒學分析對于患者的臨床用藥具有明確的指導價值。研究顯示，拉米夫定與阿德福韋酯聯合用藥對拉米夫定耐藥特別是基因B型HBV更有效［9］，但應考慮長期用藥會產生耐藥性的風險［10］。本研究中利用毛細管電泳法檢測HBV，基因分型和耐藥位點，可指導臨床抗病毒藥物的正確選擇，可以提早2～3個月檢測到耐藥位點的變異情況。因此，適時進行基因耐藥的檢測，可以預防“病毒學突破”的發(fā)生，先于臨床發(fā)現耐藥現象，可及時指導臨床選擇抗病毒藥物，從而避免人力、物力、財力的極大浪費，提高抗病毒藥物的療效，在一定程度延緩患者由慢性乙型病毒性肝炎發(fā)展為肝硬化、肝癌。

參考文獻：

［1］謝秀琴，許家璋，李 平，等.江蘇地區(qū)乙型肝炎病毒基因分型及其臨床意義［J］. 疾病控制雜志，2005，9（2）：171 －173.

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［8］方軍偉，顧美芬.拉米夫定治療B、B＋C、C基因型慢性病毒性乙型肝炎患者的臨床療效觀察 ［J］. 中國預防醫(yī)學雜志，2009，10（6）：532－533.

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［10］田珊紅，胡金華，張 寶，等.阿德福韋酯聯合拉米夫定治療HBV YMDD變異慢性乙型肝炎療效分析［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2013，16（1）：7 － 8.