蔡紅燕，劉 英，陳石良

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023;2.湖北奧彤生物制品科技有限公司，湖北孝感432600)

豬血紅蛋白含有豐富的蛋白質(zhì)和血紅素。血紅蛋白經(jīng)蛋白酶水解后可以將其分解為小分子肽，這些小分子肽類消化吸收快，且具有多種生物活性［1-2］。雖然經(jīng)過(guò)酶解，血紅蛋白的功能特性及消化吸收率得到了提高，但在酶解過(guò)程中，由于呈色物質(zhì)血紅素的存在，致使最終產(chǎn)品呈黑褐色，即使在食品中添加的量很少，也會(huì)影響整個(gè)食品的色澤，這極大地限制了血紅蛋白酶解產(chǎn)物的應(yīng)用。因此，研究血紅蛋白酶解液的脫色方法是極其必要的。

目前，血紅蛋白酶解液脫色的方法有物理法、化學(xué)法和酶解法［3-5］，其中活性炭吸附法是最常見(jiàn)的一種物理脫色方法。但單純使用活性炭吸附法也存在一些問(wèn)題，比如活性炭用量大，再生困難，吸附有效成分多，血紅素回收困難等。因此，血紅蛋白酶解液脫色的方法還需進(jìn)一步研究。

筆者研究傳統(tǒng)的活性炭吸附法與pH沉降—活性炭吸附法對(duì)血紅蛋白酶解液脫色的影響，比較兩種脫色方法的工藝參數(shù)，探討最佳的脫色方法，為血紅蛋白肽的純化及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

豬血紅蛋白酶解液，自制。蛋白酶，廣州諾維信公司提供。

1.2 主要儀器及設(shè)備

KDN-103F自動(dòng)定氮儀，上海纖檢儀器有限公司;754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海現(xiàn)科分光儀器有限公司;DL7M臺(tái)式離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器公司;HH恒溫水浴鍋，江蘇中大儀器廠;PHS-25型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 測(cè)定方法

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法為GB 5009.5-2010;灰分含量的測(cè)定方法為GB 5009.4-2010。

1.4 酶解液的制備

酶解液的制備工藝如圖1所示。

圖1 酶解液的制備工藝

1.5 脫色工藝條件的研究

1.5.1 活性炭吸附法脫色工藝參數(shù)的研究

將酶解液稀釋5倍后取50 mL稀釋液，加入活性炭脫色，吸附完成后過(guò)濾，濾液在385 nm處測(cè)定吸光值［6］，吸光值越小說(shuō)明脫色效果越好。分別研究脫色的 pH 值(3，3.5，4，4.5，5)、溫度(30 ℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃)、活性炭用量(1%，2%，3%，4%，5%)及脫色時(shí)間(20 min，40 min，60 min，80 min，100 min)對(duì)血紅蛋白酶解液脫色效果的影響，確定活性炭吸附法的最佳工藝參數(shù)。

1.5.2 pH沉降—活性炭吸附法工藝參數(shù)研究

分別取酶解液 50 mL，調(diào)節(jié) pH 值到 5.8，6.8，7.8，沉降離心后觀察酶解液的顏色，確定沉降的pH值。

將酶解液的pH值調(diào)到5.8，沉降離心后取上清液50 mL，加入活性炭脫色，脫色后過(guò)濾，濾液在385 nm處測(cè)定吸光值，分別研究溫度(15℃，25℃，35℃，45 ℃，55 ℃)、活性炭添加量(0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%)及時(shí)間(0 min，15 min，30 min，45 min，60 min)對(duì)酶解液脫色的影響，確定最佳的工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性炭吸附法脫色工藝的研究

2.1.1 pH值對(duì)活性炭脫色效果的影響

由圖1可以看出，隨著pH值的升高，酶解液的吸光值先降低后升高。當(dāng)pH值由3升高到4.5時(shí)，吸光值逐漸降低，當(dāng)pH值由4.5上升到5時(shí)，吸光值急劇增加。pH值為4.5時(shí)吸光值最低，說(shuō)明此時(shí)活性炭的脫色效果最佳，這可能與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有關(guān)。所以脫色的最佳pH值為4.5。

圖1 pH值對(duì)活性炭脫色效果的影響

2.1.2 溫度對(duì)活性炭脫色效果的影響

由圖2可知，隨著活性炭脫色溫度的升高，酶解液的吸光值逐漸降低。當(dāng)溫度由30℃上升到70℃時(shí)，吸光值迅速降低，而當(dāng)溫度由70℃上升到80℃時(shí)，吸光值變化不明顯，說(shuō)明再升高溫度對(duì)活性炭的脫色效果影響不大，所以活性炭脫色對(duì)的最佳溫度為70℃。

圖2 溫度對(duì)活性炭脫色效果的影響

2.1.3 活性炭用量對(duì)活性炭脫色效果的影響

如圖3所示，酶解液的吸光值隨著活性炭用量的增加而降低，說(shuō)明活性炭用量的增加有利于脫色效果的提高。當(dāng)活性炭用量由1% 增加到3%時(shí)，吸光值降低明顯，而當(dāng)活性炭用量由3%增加到5%時(shí)，吸光值降低緩慢。雖然活性炭用量的增加會(huì)提高脫色的效果，但增大活性炭用量的不但增加了生產(chǎn)成本，同時(shí)還會(huì)吸附酶解液中的蛋白質(zhì)，所以活性炭的用量并不是越多越好。綜合考慮脫色效果、經(jīng)濟(jì)效益和有效成分的損失，活性炭脫色的最佳用量為3%。

圖3 活性炭用量對(duì)活性炭脫色效果的影響

2.1.4 脫色時(shí)間對(duì)活性炭脫色效果的影響

由圖4可知，酶解液的吸光值隨著活性炭脫色時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。前60 min吸光值降低得較快，脫色效果明顯。60 min以后，繼續(xù)延長(zhǎng)脫色時(shí)間，酶解液的吸光值變化較為緩慢，說(shuō)明此時(shí)活性炭的吸附能力已接近飽和。且當(dāng)脫色時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，酶解液的色澤已經(jīng)比較淺，已達(dá)到了脫色的目的。所以脫色時(shí)間選擇60 min。

圖4 脫色時(shí)間對(duì)活性炭脫色效果的影響

2.2 pH沉降—活性炭吸附法工藝參數(shù)的研究

2.2.1 沉降pH值的選擇

分別取50 mL酶解液，調(diào)節(jié)pH值為7.8(酶解液原始 pH 值約為7.8)，6.8 及5.8，沉降離心后觀察溶液顏色的變化，其結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 沉降pH值對(duì)脫色效果的影響

當(dāng)血紅蛋白酶解液的pH值為7.8時(shí)，酶解液為黑褐色。當(dāng)pH降低到6.8時(shí)，酶解液中雖然有少量沉淀產(chǎn)生，但酶解液的顏色依然是黑褐色。但當(dāng)pH值降低到5.8時(shí)，酶解液中產(chǎn)生大量沉淀，沉降離心后，可以得到金黃色透明的溶液，此時(shí)，酶解液的色澤已發(fā)生了質(zhì)的變化。若繼續(xù)降低pH值，雖然可以去除更多的呈色物質(zhì)，但也會(huì)增加生產(chǎn)過(guò)程中酸和堿的用量，同時(shí)還會(huì)增加產(chǎn)品中的鹽分，影響產(chǎn)品質(zhì)量。所以沉降時(shí)最佳的pH值為5.8。

2.2.2 脫色溫度對(duì)脫色效果的影響

由圖5可知，隨著溫度的增高，吸光值逐漸降低。當(dāng)溫度由15℃上升到35℃時(shí)，吸光值降低迅速，脫色效果明顯。但當(dāng)溫度由35℃增加到55℃時(shí)，吸光值降低緩慢，脫色效果增加并不明顯。這可能是因?yàn)槊附庖褐写蟛糠稚匾驯晃降木壒?。所以吸附時(shí)的最佳溫度為35℃。

圖5 脫色溫度對(duì)pH沉降—活性炭吸附法脫色效果的影響

2.2.3 活性炭用量對(duì)脫色效果的影響

由圖6可以看出，酶解液的吸光值隨著活性炭用量的增加逐漸減小。當(dāng)活性炭用量由0.5%增加到1.5%時(shí)，吸光值降低明顯。但當(dāng)活性炭用量由1.5%增加到2.5%時(shí)，吸光值降低緩慢。綜合考慮脫色效果、經(jīng)濟(jì)效益和有效成分的損失，活性炭最佳的用量為1.5%。

圖6 活性炭用量對(duì)pH沉降—活性炭吸附法脫色效果的影響

2.2.4 脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

由圖7可以看出，隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液的吸光值先急劇降低，當(dāng)時(shí)間超過(guò)15 min后，吸光值降低緩慢，這可能是因?yàn)槊附庖褐写蟛糠殖噬镔|(zhì)已被吸附的緣故。綜合考慮脫色效果和生產(chǎn)效率，選擇脫色時(shí)間為15 min。

圖7 脫色時(shí)間對(duì)pH沉降—活性炭吸附法脫色效果的影響

2.3 兩種脫色方法的比較

將酶解液分別用兩種不同的方法脫色，脫色后調(diào)節(jié)pH值到中性，冷凍干燥后測(cè)定產(chǎn)品中蛋白質(zhì)及灰分的含量，其結(jié)果見(jiàn)表3。兩種脫色方法工藝參數(shù)的比較如表3所示。

表2 兩種脫色方法產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)的比較

表3 兩種脫色方法工藝參數(shù)的比較

結(jié)合表2和表3可以看出，采用pH沉降—活性炭吸附法較傳統(tǒng)的活性炭吸附法有較多的優(yōu)點(diǎn)。pH沉降—活性炭吸附法只需將pH值調(diào)到5.8，操作過(guò)程中節(jié)約了酸堿的使用量，使得產(chǎn)品中鹽分含量大大降低。同時(shí)沉降離心后的沉淀中含有大量的血紅素，此時(shí)因?yàn)檫€沒(méi)有添加活性炭，血紅素可以直接得到利用。此外，pH沉降—活性炭吸附法較活性炭吸附法脫色溫度低，活性炭用量少，且脫色時(shí)間短，這不斷節(jié)約了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，而且還提高了產(chǎn)品的質(zhì)量。采用pH沉降—活性炭脫色法得到的產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的含量可提高到85.60%，灰分含量可降低到4.51%。

3 結(jié)論

(1)活性炭吸附法脫色的最佳工藝為:pH值為4.5，脫色溫度為70℃，活性炭用量為3%，脫色時(shí)間為60 min。

(2)pH沉降—活性炭吸附法脫色的最佳工藝為:沉降pH值為5.8，脫色溫度為35℃，活性炭用量為1.5%，脫色時(shí)間為15 min。

(3)pH沉降—活性炭吸附法生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率高，產(chǎn)品質(zhì)量好，是一種較為理想的脫色方法。

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