王文翔，王 澍，佘 雋，田 華，陳 濤，何東平

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北武漢430023;2.武漢博特爾油脂科技有限公司，湖北武漢430040;3.中國科學院武漢病毒研究所，湖北 武漢430060)

花生四烯酸(Arachidonic Acid，簡稱 ARA，下同)的中文全稱為 5，8，11，14-二十碳四烯酸，是哺乳動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣的一種多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid，簡稱 PUFA，下同)，屬n－6系列，簡記為C20:4(n－6)，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 花生四烯酸的結(jié)構(gòu)式

ARA在人體內(nèi)不能自行合成，但對人體的生命活動必不可少，它是細胞膜的重要成分，在維持細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能上發(fā)揮著重要的作用;也是人體前列腺素合成的前體物質(zhì)，對人體的生理功能有著重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，ARA還有著保護皮膚、降低膽固醇、抑制血小板聚集、提高免疫能力、促進胎兒發(fā)育等［1－2］獨特的生理功能。目前，ARA主要來源于動物肝臟、魚油、豬腎上腺等，但其含量都很低，不能滿足市場需求，也難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)ARA的新途徑［3］，不受原料、氣候和產(chǎn)地等的限制，具有生長周期短，培養(yǎng)方法簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，易于規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化，引起了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注［4－8］。從菌種安全性考慮，高山被孢霉(Mortierella alpina)屬于接合菌綱毛霉目被孢霉科被孢霉屬［9］，無變應原性和毒性［10－11］，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時，菌體內(nèi)會逐步累積油脂，且ARA含量較高，因此利用其生產(chǎn)花生四烯酸是可行的。

培養(yǎng)基對高山被孢霉產(chǎn)ARA有著十分重要的影響，其組成主要包括碳源、氮源和無機鹽等。傳統(tǒng)的碳源主要是葡萄糖，鑒此，筆者以實驗室保藏的ARA菌株Mortierella alpina 200012201－12－2－2(簡稱12－2－2，下同)為出發(fā)菌株，采用添加淀粉的方法，通過測定糖氮代謝曲線，以生物量、含油率和ARA產(chǎn)量為綜合評價指標，研究其對高山被孢霉產(chǎn)ARA的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

SW－CJ－1F單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;YM75立式壓力蒸汽滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司;HYQ－150S全溫搖床，武漢匯誠生物科技有限公司;K9840自動凱式定氮儀，山東濟南海能儀器有限公司;XSP－BM－2CA生物顯微鏡，上海光學儀器廠;SPX－150C恒溫恒濕培養(yǎng)箱，常州中捷實驗儀器制造有限公司，SK3300LHC超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司;GZX－9070 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;TSZ5－WS小型臺式高速冷凍離心機，湖南長沙平凡儀器儀表有限公司;SP－2560氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司;索式抽提器和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，武漢集思儀器設(shè)備有限公司。

1.2 菌株

高山被孢霉突變株12－2－2，由本實驗室通過60Co－γ射線輻照誘變選育所得。冰箱中4℃條件下PDA斜面保藏，每隔3個月傳代一次。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯(250 g/L)的浸出液，葡萄糖20 g/L，瓊脂 20 g/L，pH自然，115℃滅菌 25 min。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖30 g/L，酵母膏10 g/L，MgSO40.1 g/L，KH2PO40.1 g/L，pH 6.5—7.5，500 mL三角瓶裝液100 mL，115℃滅菌25 min。

對照組發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖60 g/L，酵母膏20 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH6.5—7.5，500 mL三角瓶裝液100 mL，115℃滅菌25 min。

實驗組發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖60 g/L，淀粉20 g/L，酵母膏 20 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH6.5—7.5，500 mL 三角瓶裝液 100 mL，115℃滅菌25 min。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌株活化

將冰箱中PDA斜面保藏的高山被孢霉突變株12－2－2轉(zhuǎn)接到PDA平板上于26℃培養(yǎng)4—5 d，活化。

1.4.2 種子培養(yǎng)

用灼燒后的無菌環(huán)挑取少許經(jīng)活化后的菌絲，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，在26℃，180 r/min的條件下，培養(yǎng)3 d。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

用滅過菌的吸管吸取10 mL種子液，轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在26℃，180 r/min的條件下，培養(yǎng)8 d。

1.5 分析方法

1.5.1 平板觀察

挑取活化后長勢良好的平板，觀察其形態(tài)特征。

1.5.2 顯微鏡觀察

分別挑取長勢良好的對照組和實驗組的發(fā)酵瓶菌絲體，涂片，用顯微鏡觀察兩組菌絲體形態(tài)上的不同特征，并拍照。

1.5.3 糖氮代謝曲線的測定

發(fā)酵液經(jīng)2 000 r/min離心10 min，取上層液2 mL至50 mL容量瓶，蒸餾水稀釋定容，糖耗采用蒽酮—硫酸法［12］，氮耗采用凱式定氮法［13］，每隔 24 h測定一次，連續(xù)測定8 d。

1.5.4 生物量的測定

取一塊干凈的紗布，過濾已培養(yǎng)8 d的發(fā)酵液，經(jīng)蒸餾水洗滌兩次后，將收獲的菌絲體于60℃烘箱中烘至恒重，稱量并計算生物量。

1.5.5 含油率的測定

干菌體研缽磨成粉末后采用Soxhlet法［13］提取油脂，并計算其得率。

1.5.6 ARA 含量的測定

取菌體油脂0.1 g加2 mL3%KOH-甲醇溶液，75℃振蕩15 min水解。水解后，加2 mL 14%三氟化硼—甲醇溶液，于70℃振蕩2 min甲酯化。然后，加2 mL飽和 NaCl溶液分層，最后加正己烷1 mL，振蕩取上清液進樣。

色譜柱 SP-2560，載氣為氮氣/空氣，分流比15∶1，進樣口溫度250℃，F(xiàn)ID2檢測器溫度260℃，壓力2.4 kPa，進樣量1μL，根據(jù)峰面積和標準工作曲線計算ARA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體形態(tài)

由圖2可見，在搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)后，對照組的菌絲體呈細絲狀分布，膨大鼓起的部位較少且不明顯;而實驗組的菌絲體呈藕節(jié)狀分布，膨大鼓起的部位較多且很明顯。據(jù)此可以初步判斷，淀粉的添加對高山被孢霉菌絲的生長和油脂的累積有一定的促進作用，其菌絲生長的更為粗壯，膨大端更為明顯，菌絲體內(nèi)透明的油滴狀物質(zhì)更多，油脂含量更高。

圖2 對照組(左)與實驗組(右)的菌絲體形態(tài)

2.2 糖代謝曲線

由圖3可得，不論是對照組還是實驗組，糖耗在第1天到第3天都是逐漸增大，在第3天分別達到了16.01 g/L和24.54 g/L;而到了第4天，糖耗出現(xiàn)了驟升，分別為35.21 g/L和44.67 g/L。第4天之后，對照組和實驗組的糖耗又繼續(xù)逐漸增大，直至第8天達到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，分別為57.01 g/L和59.37 g/L。因為實驗組最終穩(wěn)定的糖耗只比對照組略高，可初步推斷淀粉被分解吸收的很少，其充當碳源的作用沒有葡萄糖明顯。

圖3 對照組與實驗組的糖代謝曲線

由圖3也可發(fā)現(xiàn)對照組和實驗組的糖代謝曲線有著明顯的差別:雖然其在第7天穩(wěn)定后的糖耗差別不大，但第1天到第6天，實驗組的糖耗都要高于對照組。據(jù)此可以初步判斷，淀粉的添加雖然對高山被孢霉搖瓶發(fā)酵時的最終糖耗沒有明顯的影響，但會影響糖消耗的速率，添加淀粉之后，糖的消耗速率有了明顯的增大，更快地達到了穩(wěn)定。

2.3 氮代謝曲線

由圖4可見，不論是對照組還是實驗組，第1天到第3天的氮耗速率都要大于第4天到第8天。第1天到第3天，氮耗逐漸增大，在第3天分別為16.41g/L和17.95 g/L;第4天之后，氮耗速率明顯減小，到第7天已基本趨于穩(wěn)定，分別為19.31 g/L和 19.85 g/L。

圖4 對照組與實驗組的氮代謝曲線

另外，對照組和實驗組的氮代謝曲線也有較大的差別:第1天到第8天，實驗組的氮耗速率都比對照組要大，直至最后趨于穩(wěn)定。據(jù)此可以初步推斷，淀粉的添加對高山被孢霉搖瓶發(fā)酵時的氮代謝過程也有一定的影響，添加淀粉之后，雖然其最終氮耗沒有明顯的變化，但氮的消耗速率有了一定的增大。

2.4 生物量、含油率和ARA產(chǎn)量

對照組和實驗組的生物量、含油率和ARA產(chǎn)量見表1。

表1 對照組與實驗組的生物量、含油率和ARA產(chǎn)量

由表1可得，實驗組的生物量、含油率和ARA產(chǎn)量都要明顯高于對照組，分別達到了30.57 g/L，41.16%和4.65 g/L。據(jù)此可以判斷，淀粉的添加對高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸有明顯的影響，生物量、含油率和ARA產(chǎn)量在添加淀粉后都有明顯的增大。

綜合菌絲體形態(tài)和糖氮代謝過程，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的可能原因是淀粉是一種固形物，雖然在搖瓶發(fā)酵的過程中充當碳源的作用很微弱，沒有葡萄糖明顯，但其添加使得菌絲體在生長時有了附著物，生長的更為分散，更不容易聚集成團，與周圍營養(yǎng)成分的接觸面積也就增大了。在發(fā)酵培養(yǎng)初期，實驗組能夠更好地吸收氮源，菌絲體生長的更為迅速和粗壯，生物量增大;發(fā)酵培養(yǎng)中后期，實驗組能更為高效的吸收碳源，代謝活動更為旺盛，代謝產(chǎn)物積累的速率加快，其油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量也隨之增大了。

3 結(jié)論

淀粉對高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸有促進作用。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2%的淀粉后，生物量、含油率和 ARA 產(chǎn)量各為 30.57 g/L，41.16% 和 4.65 g/L，分別是未添加淀粉的1.09倍，1.18倍和1.53倍。淀粉充當碳源的作用很微弱，沒有葡萄糖明顯，但其作為一種固形物起到了菌絲體生長附著物的功能，使菌絲體在生長時分散開來，更不容易聚集成團，有益于菌絲體對周圍營養(yǎng)成份的吸收，代謝產(chǎn)物的積累速度和積累量也隨之增大。隨著研究工作的繼續(xù)深入，優(yōu)化培養(yǎng)及發(fā)酵技術(shù)的成熟，高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸的生物量、含油率和ARA產(chǎn)量均有較大的提升可能性。

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