馮承恩，李潤(rùn)祥，黃慶芳，丁 瑩

(1. 廣東藥學(xué)院 醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東 中山528458；2.廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州510095)

?

金銀花對(duì)小鼠皮膚光老化的保護(hù)作用

馮承恩1，李潤(rùn)祥2，黃慶芳1，丁 瑩1

(1. 廣東藥學(xué)院 醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東 中山528458；2.廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州510095)

目的：研究金銀花醇提取物對(duì)紫外線致小鼠皮膚光老化的保護(hù)作用。方法：將60只小鼠隨機(jī)分成5組：正常對(duì)照組、模型組、模型+基質(zhì)組、模型+低劑量金銀花組及模型+高劑量組,除對(duì)照組外，其它各組小鼠模擬日光紫外線(UVA+UVB)光老化皮膚損傷照射，建立光老化動(dòng)物模型。觀察皮下血管及皮膚結(jié)構(gòu)改變，測(cè)定皮膚丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)活性。結(jié)果：低、高劑量金銀花組小鼠與空白組相比，波浪狀彈性纖維，斷裂及卷曲程度較輕；與模型組相比，皮膚MDA含量降低，GSH-px含量減少，而SOD含量有所增加。結(jié)論：金銀花提取物對(duì)紫外線照射后小鼠光老化有一定的保護(hù)作用。

金銀花；紫外線；皮膚光老化

金銀花(honeysuckle flower)是忍冬科植物忍冬及同屬多種植物的干燥花蕾，其主要活性組分為綠原酸，具有抗炎、抗氧化、利膽保肝、降血脂等藥理活性[1]，廣泛用于食品保鮮劑和抗衰老劑等[2]。但其醇提取物對(duì)紫外線照射引起小鼠皮膚光老化的防護(hù)作用卻少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過模擬紫外線建立小鼠光老化動(dòng)物模型，觀察金銀花醇提取物對(duì)皮膚光老化的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

取金銀花32g，與60%乙醇按固液比1∶25溶解，浸提溫度80℃，提取2次，時(shí)間均為1h，提取液合并過濾濃縮后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動(dòng)物

KM小鼠60只，體重(18～22)g，6周，雌性，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK(粵)2006-0015)。

1.3 試劑

金銀花(廣州致信中藥飲片有限公司，批號(hào)：Y2012007)?？捡R斯亮蘭蛋白測(cè)試、丙二醛試劑測(cè)定盒(批號(hào)：20121009)、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶試劑測(cè)定盒(批號(hào)：20121209)，試劑盒均來自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器

SS-01型紫外線光療儀(上海希格瑪高技術(shù)有限公司)，UV1102紫外可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將小鼠60只隨機(jī)分成空白組、模型組、模型+基質(zhì)組、模型+低劑量金銀花組及模型+高劑量組 5組，每組12只。

2.2 模擬紫外線照射小鼠致光老化

參考國(guó)內(nèi)光老化動(dòng)物模型方法建立動(dòng)物模型[3]。照射前，剃掉背部約2cm×3cm的皮發(fā)。模型組不涂藥，金銀花組涂0.1mL(低、高劑量濃度分別為0.2g/mL、0.4g/mL)的金銀花醇提取物，基質(zhì)組涂60%乙醇，空白對(duì)照組外用生理鹽水30min，除空白對(duì)照組外，各組小鼠模擬紫外線光老化皮膚損傷照射。固定小鼠，頭部區(qū)遮光，40W UVB燈管2根(312nm)及40W UVA燈管2根(365nm)模擬日光組合配置照射。UVA輻照強(qiáng)度1.12mW/cm，UVB輻照強(qiáng)度0.118mW/cm。輻照時(shí)間以小鼠皮膚開始出現(xiàn)輕度泛紅為準(zhǔn)，并按小鼠耐受適應(yīng)性的增強(qiáng)做漸進(jìn)性增時(shí)調(diào)整。2天1次，連續(xù)12周，累計(jì)照射劑量約為UVA 198 J/cm2，UVB 4.26J/cm2。

2.3 MDA含量及SOD、GSH-px活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物后，立即取下背部脫毛區(qū)全層皮膚，觀察其皮下血管的變化。取1/3皮膚作理病組織切片。另取背部1/3皮膚，刮除皮下脂肪，將皮膚剪成肉糜狀，按9倍皮膚重量的生理鹽水混合放入冰水中勻漿，勻漿時(shí)間10s/次，間隙30s，連續(xù)5次，打成5%乳白色勻漿，4℃下以3500r/min離心10min，取上清液，按試劑盒說明分別測(cè)定SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察皮下血管變化

空白組小鼠皮膚無結(jié)節(jié)、血管正常，模型組小鼠皮膚粗糙、松弛干燥、脫屑，出現(xiàn)粗深皺紋，皮膚色素沉著，血管出現(xiàn)嚴(yán)重血瘀點(diǎn)，小鼠皮膚光老化模型成功；金銀花低劑量組皮膚較平滑，稍松弛，出現(xiàn)輕微充血；金銀花低高劑量組皮膚表面光滑，無充血現(xiàn)象。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重比無顯著性差異(P>0.05)。

3.2 光鏡下真皮彈性纖維病理學(xué)改變

空白組小鼠真皮層可見波浪狀彈性纖維，無卷曲扭結(jié)，排列有序。模型組小鼠皮膚彈性纖維發(fā)生變性或消失，纖維呈嗜堿性變，出現(xiàn)變粗、扭結(jié)聚集，甚至消失；金銀花高、低劑量組小鼠真皮層彈性纖維波浪狀，少見斷裂、破碎，與模型組比較有所改善。金銀花高、低劑量組之間有一定的差別，高劑量組的彈性纖維受損程度較輕。

3.3 皮膚組織中SOD、MDA及GSH-px測(cè)定結(jié)果

與模型組相比，金銀花醇提取物高、低劑量組SOD活性明顯下降，MDA含量明顯增加，GSH-px活性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并呈明顯的劑量依賴性，見表1。

4 討論

近年來，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用多種不同中藥或其提取物對(duì)皮膚光老化的防治取得了頗有成效的研究[4]。《本草綱目》記載金銀花“久服輕身，延年益壽”，夏秋服用金銀花茶能防暑降溫、降脂減肥、養(yǎng)顏美容。對(duì)一百多種中藥材的紫外吸收率研究[5]，發(fā)現(xiàn)金銀花的平均紫外吸收率分別為：20.9(UVA)、51.1(UVB)、70.4(UVC)。孫莎莎等[6]研究發(fā)現(xiàn)金銀花提取物在錦綸上具有吸附和抗紫外線性能。

以往關(guān)于紫外線對(duì)皮膚老化的作用研究，多采用單一光源(UVB或UVA)，注重于短時(shí)間大劑量紫外線照射后引起的生化改變或長(zhǎng)時(shí)間慢性照射后的皮膚形態(tài)學(xué)改變。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合光源(UVB+UVA)模擬日光，更符合自然條件，長(zhǎng)時(shí)間中小劑量紫外線照射小鼠皮膚，可最大程度地模擬皮膚光老化的生理過程。模型組小鼠皮膚組織的SOD降低，MDA升高，真皮纖維排列紊亂，可能因紫外線照射使皮膚組織內(nèi)產(chǎn)生大量自由基或使組織抗氧化防御體系作用減弱所致，由此可見模擬紫外光照射致小鼠皮膚光老化模型建立成功。

組別SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)GSH-px(U/mgprot)空白組243.98±34.9633.11±2.998.43±1.89模型組188.79±19.44#87.28±4.12#1.66±1.62##模型+基質(zhì)組192.17±12.8183.05±3.031.98±1.46模型+低劑量組221.89±28.32*46.52±1.87*3.32±1.63模型+高劑量組225.00±24.67**40.52±2.73**6.77±1.34*

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.001；與空白組比較，#P<0.05，##P<0.05。

將金銀花醇提取液作為外用劑型，經(jīng)皮膚用于剃毛后的昆明小鼠皮膚，可明顯提高小鼠皮膚組織中MDA含量，降低SOD、GSH-px活性；而高劑量金銀花組能顯著減少UVR輻射所致小鼠皮膚組織中MDA的生成，降低細(xì)胞損傷的程度，減少細(xì)胞毒性及蛋白質(zhì)、核酸等大分子真皮結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合作用，同時(shí)顯著提高SOD及GSH-px活性，表現(xiàn)出不同程度的光保護(hù)效果。推測(cè)金銀花外用抗光老化作用可能通過減少氧化產(chǎn)物生成，提高抗氧化物酶活性，保護(hù)細(xì)胞免于氧化損傷，并可使氧化變性的大分子功能還原恢復(fù)，從而達(dá)到抗皮膚光老化作用[7-10]。

在光老化發(fā)生機(jī)制中，目前已經(jīng)公認(rèn)的有活性氧簇自由基學(xué)說、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)學(xué)說、線粒體損傷學(xué)說等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金銀花醇提取液可以提高光老化皮膚抗氧化物酶活性，改變氧化產(chǎn)物含量，達(dá)到抗皮膚光老化作用。

[1] 全國(guó)中草藥編寫組.全國(guó)中草藥匯編上冊(cè)[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:553.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典(一部)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005:196-197.

[3] 郭魯義，李春雨，張寧，等．實(shí)用光老化動(dòng)物模型建立方法的探討[J]．中國(guó)美容學(xué),2008，17(2)：235-237.

[4] 陳紹斐，馬麗俐．中藥對(duì)皮膚光老化防治作用的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2008，7(1)：57-60.

[5] 陳淑映，羅德祥，何錦鈞，等.一百種常用中草藥乙醇提取液的防曬性能測(cè)定[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2005，11(6):67-69.

[6] 孫莎莎.金銀花提取物在錦綸上的吸附和抗紫外性能[J].印染，2009，35(22)：4-8.

[7] 沈玲玲，胡志軍，王志良，等. 金銀花中總黃酮的提取及其消除自由基的研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22( 5)：1169-1171.

[8] 楊新建，段素云，宋琳琳，等．金銀花中總黃酮的提取及其抗氧化活性的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40( 12) :7047-7049.

[9] 張澤生，烏蘭．金銀花中綠原酸的體外抑菌和抗氧化性的研究[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào),2005，20( 2) : 5-8,34.

[10] WU LAN. Effect of chlorogenic acid on antioxidant activity of Flos Lonicerae extracts[J] .Jouranl of Zhejiang University Science B,2007,8(9):673-679.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

Honeysuckle Light on The Skin of Mice After Exposure to UVA Protective Effect

Feng Chengen1，Li Run xiang2，Huang Qingfang1，Ding Ying1

(1.Chemistry and Chemical Engineering Department of Guang Dong Pharmaceutical University，Zhongshan 528458 ；2.Guangzhou Institute of Dermatology，Guangzhou 510095)

Objective:To study the influence of honeysuckle extract using on Photo-aging mice skin caused by UV radiationt.Methods:The 60 mice were randomly divided into five groups：normal control group, photo-aging model group, model+ matrix group , model+ honeysuckle extract low-dose group and model+ honeysuckle extract high-dose group . The photo-aging skin mice models were obtained long-term by UV exposure. To observe the back surface of the skin changes and changes in dermal blood vessels, simultaneous detection of the malondialdehyde(MDA)、superoxide diamutase (SOD)and glutathione peroxidase(GSH-px) by biochemical methods.Results:Few broke、convolute、amorphous elastic fibers were observed in the groups treated with low and high dose group，and some wavy elastic fibers were also observed. Skin decreased SOD activity, MDA content increased. Compare to the photo-aging model group, skin MDA content was lower, SOD content increased, and the high dose than low dose significantly.Conclusion:The extract of honeysuckle has a photo protective effect on the skin of photo-aging mice.

Honeysuckle; UV; Photo-aging

2014-04-14

馮承恩(1978-)，女，廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)槠つw病藥理學(xué)。

李潤(rùn)祥(1976-)，男，廣州市皮膚病防治所副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槠つw性病學(xué)。

R285.5

A

1673-2197(2014)12-0003-02