王 瑾，譚茂蘭，汪云偉，黃勤挽

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

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中藥益智仁鹽炙對正常大鼠結(jié)腸水通道蛋白4影響研究

王 瑾，譚茂蘭，汪云偉，黃勤挽*

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

目的：觀察益智仁鹽炙對正常大鼠結(jié)腸水通道蛋白4(AQP4)的影響，研究益智仁燥性及鹽炙潤燥的作用機(jī)制。方法：將SPF級SD大鼠分為正常動(dòng)物組、生益智仁組、鹽益智仁組、清水炒益智仁組、生益智仁加鹽組及生益智仁加增液湯組，各組動(dòng)物每天灌胃給藥1次，連續(xù)28 天。于第28天處死動(dòng)物，剖取結(jié)腸組織，采用免疫組織化學(xué)檢測結(jié)腸中AQP4 的表達(dá)情況。結(jié)果：與正常動(dòng)物組比較，生益智仁組結(jié)腸AQP4表達(dá)顯著增加(P<0.01)；與生益智組比較，鹽益智仁組、清水炒益智仁組、生益智仁加鹽組及生益智仁加增液湯組結(jié)腸AQP4表達(dá)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：益智仁能增加正常大鼠結(jié)腸AQP4表達(dá)，促進(jìn)腸道水分重吸收，從而造成便秘，體現(xiàn)其燥性效應(yīng)；而益智仁鹽炙后能降低其引起的燥性效應(yīng)，其作用機(jī)制與鹽炙過程中的加熱炒制和輔料食鹽有關(guān)。關(guān)鍵詞：益智仁；鹽炙；大鼠結(jié)腸；水通道蛋白4

益智為姜科山姜屬植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果實(shí)，藥用部位為種仁。益智仁藥用歷史悠久，中醫(yī)傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為其生品辛溫而燥，長于溫脾止瀉、攝涎唾力勝；而鹽炙后其辛燥之性減弱，專行下焦，長于固精、縮尿。課題組前期研究表明，益智仁對小鼠腸腔水分,特別是大腸腸腔水分有顯著的減少作用，說明益智仁引起動(dòng)物出現(xiàn)便秘癥狀原因之一為加強(qiáng)小腸、大腸腸腔水分的重吸收[1]。水通道蛋白是一類具有高度選擇性的運(yùn)輸水的膜通道蛋白家族，在哺乳動(dòng)物組織中已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白亞型[2]，其中水通道蛋白3、4、8(AQP3、AQP4、AQP8)等在結(jié)腸中分布表達(dá)并參與結(jié)腸水分重吸收過程[3-4]。

益智仁促進(jìn)腸道水分重吸收的機(jī)制是否與AQP4有關(guān)？鹽炙后有何影響？影響的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是什么？上述問題均無相關(guān)報(bào)道。本文觀察了灌胃給予正常大鼠益智仁、鹽益智仁對其結(jié)腸組織AQP4表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與試劑

1.1 儀器

Motic BA400顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪公司)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；QYC-200型恒溫?fù)u床(上海?，敼?；徠卡-2015切片機(jī)(德國克林藍(lán)公司)；TSJ-Q型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威醫(yī)療儀器有限公司)；Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc.公司)。

1.2 藥材與供試品制備

益智AlpiniaoxyphyllaMiq.購于海南省中藥材公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心盧先明教授鑒定為益智，符合《中國藥典》2010年版相關(guān)規(guī)定，將其制備成生益智仁、鹽益智仁、清水炒益智仁3種飲片，分別用70%乙醇提取，回收乙醇，分別制備成2g·mL-1、1g·mL-1藥液；取部分1g·mL-1生益智仁藥液，按2%(w/v)加入食鹽；另購玄參、麥冬、生地3種飲片，按《溫病條辨》中“增液湯”配方，煎煮濃縮至2g·mL-1藥液，與2g·mL-1生益智仁藥液等體積混合。上述各藥液中均加入5%(v/v)吐溫-80增溶。

1.3 試劑試藥

AQP4(H-80)抗體(批號(hào)：ZS-20812)；a Rb IgG(H+L)/Bio抗體(生物素化山羊抗兔IgG)(批號(hào)：V0527)；a Mo IgG(H+L)/Bio抗體(生物素化山羊抗小鼠IgG)(批號(hào)：V0522)；辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白(HRP/A-V)(批號(hào)：V7023)；DAB顯色劑(批號(hào)：753223A)，均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。PBS緩沖液(pH7.2～7.4)：NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L。

1.4 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級，體重180～220g，雄性，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(川)2013-24。

2 方法

2.1 分組及給藥

將大鼠按體重隨機(jī)分成6組，即空白對照組、生益智仁組、鹽益智仁組、清水炒益智仁組、生益智仁加鹽組、生益智仁加增液湯組，每組6只?？瞻讓φ战M灌胃給予純水，益智仁各給藥組分別給予相應(yīng)藥液，給藥劑量均為20mL·kg-1。每天灌胃給藥1次，連續(xù)28 天。

2.2 結(jié)腸組織制片

于第28天末次給藥后1h，用水合氯醛(0.35g·kg-1)麻醉動(dòng)物，行腹中線剖開，在右側(cè)橫狀結(jié)腸處采集約1cm長的腸管，用4%多聚甲醛溶液固定，備APES處理的載玻片，常規(guī)石蠟切片，切片厚度約6～8μm。

2.3 結(jié)腸組織AQP4免疫組織化學(xué)檢測

采用免疫組織化學(xué)的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(S-P法)檢測大鼠結(jié)腸組織AQP4蛋白表達(dá)情況。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加3% H2O2溶液于玻片上，室溫靜置10min以清除內(nèi)源性過氧化酶，用蒸餾水洗3次，每次2min。將切片浸入含0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)的容器中，置于微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92～98℃之間并持續(xù)10～15min，取出容器置于室溫冷卻后用PBS緩沖液洗滌2次。切片滴加5% BSA 1滴封閉，在37℃下溫育20min，甩去多余液體，不洗。滴加1∶200稀釋的一抗(AQP4抗體)，4℃過夜，用PBS洗滌3次，每次2min；滴加二抗(生物素化山羊抗兔IgG和生物素化山羊抗小鼠IgG)，37℃孵育30min，用PBS洗滌3次，每次2min；滴加辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白工作液，37℃孵育30min，用PBS洗滌4次，每次5min。DAB顯色2min，蒸餾水洗滌。用蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

2.4 陽性細(xì)胞圖像分析處理

用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行陽性細(xì)胞積分光密度(MD)分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

陽性產(chǎn)物為棕黃色至黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞漿及細(xì)胞核周圍呈棕黃色者判為陽性，陰性細(xì)胞核為藍(lán)色。與正常動(dòng)物組比較，生益智仁組AQP4積分光密度顯著增大(P<0.01)；與生益智仁組比較，鹽益智仁組、生益智仁聯(lián)用增液湯組AQP4積分光密度顯著減小(P<0.01)，清水炒益智仁組、生益智仁外加鹽組AQP4積分光密度顯著減小(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1和圖1。

表1 益智仁鹽炙對大鼠結(jié)腸AQP4積分光密度影響 ±s，n=6)

注：生益智仁組與空白對照組比較，**P<0.01；其余各給藥組與生益智仁組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

圖1 大鼠結(jié)腸AQP4免疫組化結(jié)果

4 討論

《中國藥典》2010年版一部“益智”項(xiàng)下規(guī)定，益智仁單日用量為3～10g，若按成人日服最大用量10g、體重按50kg計(jì)算，則本實(shí)驗(yàn)所用生益智仁10g·kg-1的劑量相當(dāng)于成人日服最大劑量的50倍。在該劑量下，連續(xù)灌胃給藥正常大鼠28天，與正常動(dòng)物組比較，大鼠結(jié)腸組織AQP4積分光密度顯著增大，說明大鼠結(jié)腸組織AQP4表達(dá)有所加強(qiáng)，進(jìn)而結(jié)腸組織腸道水分重吸收加強(qiáng)，糞便含水量降低，體現(xiàn)出益智仁對正常大鼠腸道的燥性效應(yīng)。

益智仁經(jīng)過鹽炙后，能夠顯著降低因生益智仁導(dǎo)致的大鼠結(jié)腸組織AQP4表達(dá)增強(qiáng)效應(yīng)，即能夠降低生益智仁對腸道的燥性效應(yīng)，體現(xiàn)鹽炙潤燥的炮制作用原理。將鹽炙的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)分解為加熱作用和輔料作用，通過比較僅有加熱作用的樣品(清水炒益智仁組)和僅有輔料作用的樣品(益智仁加鹽組)，發(fā)現(xiàn)兩者與生益智仁相比，均能夠顯著降低因生益智仁導(dǎo)致的大鼠結(jié)腸組織AQP4表達(dá)增強(qiáng)效應(yīng)，但作用強(qiáng)度不及鹽益智仁組，故表明鹽炙潤燥是加熱炒制和食鹽輔料共同導(dǎo)致的協(xié)同作用。

增液湯為中醫(yī)臨床治療燥證的基礎(chǔ)方劑，將其與生益智仁聯(lián)合用藥，能夠顯著降低因生益智仁導(dǎo)致的大鼠結(jié)腸組織AQP4表達(dá)增強(qiáng)效應(yīng)，起到滋陰潤燥的作用，亦為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性做了驗(yàn)證。

[1] 劉靜,黃勤挽,王瑾,等.基于正常小鼠排便作用的益智仁燥性效應(yīng)表征研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(23):231-234.

[2] 楊文茜,潘冰冰,王云姣.水通道蛋白4的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2009,4(20):238-241.

[3] 汪泳,張方信,令曉玲,等.大鼠結(jié)腸中水通道蛋白4的表達(dá)與分布[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004,25(2):142-143.

[4] 吳本升,楊柏霖,周錦勇,等.“養(yǎng)陰潤腸方”對慢傳輸便秘模型大鼠結(jié)腸黏膜水通道蛋白3和水通道蛋白8的影響[J].江蘇中醫(yī)藥,2013,45(4):66-68.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Effect study ofFructusAlpiniaeOxyphyllae Stir-frying With Salt Water on AQP4 of Normal Rats Colon

Wang Jin,Tan Maolan,Wang Yunwei,Huang Qinwan*

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective:To study the effect of Fructus Alpiniae Oxyphyllae (FAO) Stir-frying with Salt Water on AQP4 of normal rats colon, so as to study the mechanism of dry effects and salt-processed moistening-dryness of FAO stir-frying with salt water.Methods:The SPF rats were divided into 6 groups: normal group, crude FAO group, FAO stir-frying with salt water and water groups, crude FAO coupled with salt group, FAO and increased liquid soup combination group. All rats were orally administered once a day for 28 d. All rats were sacrificed on the 28th day, and dissected the colon, then detected the expression of AQP4 of colon by immunohistochemistry.Results:Compared with normal group, the expression of AQP4 of crude FAO group were increased significantly(P<0.01); compared with crude FAO group, the expression of AQP4 of FAO Stir-frying with salt water and water groups, crude FAO coupled with salt group, FAO and increased liquid soup combination group were decreased significantly(P<0.05 orP<0.01).Conclusion:FAO can increase the expression of AQP4 of normal animal colon, to promote intestinal reabsorption of water, then lead to constipation and reflect its dry effects; However, FAO stir-frying with salt water can reduce its dry effects by FAO, the mechanism was related to stir-frying and salt in the process of stir-frying with salt water.

Fructus Alpiniae Oxyphyllae;Stir-frying With Salt Water; Rats Colon; AQP4

2014-02-18

國家自然科學(xué)基金(81001639)；教育部新教師基金(2010513120002)

王瑾(1983-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)助理研究員，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。

黃勤挽(1979-)，男，博士，成都中醫(yī)藥大學(xué)副教授，研究方向?yàn)橹兴幣谥茖W(xué)。

R283;R285.5

A

1673-2197(2014)10-0010-02