靳 劍，張 新

(1. 烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830000；2.烏魯木齊市燒傷醫(yī)院 藥劑科，新疆 烏魯木齊 830000)

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維藥PCR技術(shù)探析

靳 劍1，張 新2

(1. 烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830000；2.烏魯木齊市燒傷醫(yī)院 藥劑科，新疆 烏魯木齊 830000)

目的：根據(jù)PCR聚合酶鏈反應(yīng)，采用分子生物技術(shù)探析維藥在PCR方面的技術(shù)應(yīng)用。方法：采用高溫低pH法，防止組織被破壞及其它物質(zhì)的氧化，提取高純度DNA，直接用于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(PADA)等分子水平遺傳標(biāo)記PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果：大部分維藥可獲得總的DNA提取，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。結(jié)論：PCR技術(shù)鑒定維藥具有快速、簡(jiǎn)捷、方便、有效的特點(diǎn)。

維藥；高溫低pH；PCR

PCR為聚合酶鏈反應(yīng)，原理為通過(guò)利用分子生物引物，將原痕跡量DNA擴(kuò)增到足以進(jìn)行檢測(cè)與分析的數(shù)量，具有高速、高效、優(yōu)質(zhì)和全部自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)[1-3]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷深化和發(fā)展，制定新的快速、有效、簡(jiǎn)捷、專(zhuān)屬性強(qiáng)的現(xiàn)代化檢測(cè)方法勢(shì)在必行。維藥作為民族醫(yī)藥有著舉足輕重的地位，目前維藥還沒(méi)有比較規(guī)范的整套鑒定方法[4]。PCR擴(kuò)增的模板DNA作為遺傳信息載體，不受外界因素、生物發(fā)育階段及器官組織差異等影響，具有高速、高效和高特異性等特點(diǎn)[5]。從分子生物學(xué)的角度檢測(cè)藥品更能確保其質(zhì)量可靠，現(xiàn)簡(jiǎn)單探析維藥的PCR技術(shù)工藝,具體報(bào)道如下。

1 材料與試劑

1.1 維藥種類(lèi)

1.1.1 菊科 5種菊科維藥的名稱(chēng)、來(lái)源、拉丁名見(jiàn)表1。

表1 5種菊科維藥

1.1.2 豆科 10種豆科維藥的名稱(chēng)、來(lái)源、拉丁名見(jiàn)表2。

1.1.3 傘形科 9種傘形科維藥的名稱(chēng)、來(lái)源、拉丁名見(jiàn)表3。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 低溫高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)，恒溫水浴箱，恒溫?fù)u床，冰箱，電子天平，DYCP-31B型電泳，PCR儀(MJ Research PTC-100TM，Programmable Thermal ,USA)，DYY-穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀。

表2 10種豆科維藥

1.2.2 試劑 SDS(十二烷基硫酸鈉)，EDTA(乙二胺四乙酸)，β-硫基乙醇，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，氯仿，醋酸鈉，醋酸鉀，異戊醇，異丙醇，瓊脂糖，1×TBE溶液，溴乙錠，二甲基苯青，其它溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 植物藥前處理

1.4.1 高溫低pH法 該法提取的藥品DNA純度較高，主要原理為：利用低pH提取介質(zhì)，可有效防止組織被破壞、材料沉淀時(shí)的電離作用及酚化物氧化。所提取DNA純度較高，無(wú)需進(jìn)一步純化，可直接用于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RADP)等分子水平標(biāo)記。采用低pH介質(zhì)高鹽沉淀蛋白方法，可從新鮮材料或干品植物材料中提取得到總DNA。

表3 9種傘形科維藥

1.4.2 方法 市售干品藥材粉碎，過(guò)60目篩，采用去離子水清洗，紫外線照射30min，取粉末0.3g,置研缽中，加1.0g玻璃沙研磨至極細(xì)粉末。加入預(yù)熱(50℃)的緩沖液A(100mmol·L-1醋酸鈉，50mmol·L-1EDTA,500mmol·L-1NaCl,2.5%PVP，3%SDS,1%β-巰基乙醇，pH為5.5)于研缽中混勻，取10mL于離心管中，置恒溫床(56℃)溫育30min，于轉(zhuǎn)速10 000r/min離心10min。取上清液至另一離心管中，加2/3倍體積2.5M(pH為4.8)醋酸鉀洗液置于4℃冰箱保存30min，于轉(zhuǎn)速10 000r/min離心10min；轉(zhuǎn)移上清液移至另一離心管中，加等體積氯仿-異戊醇混勻，4℃、10 000r/min離心15min重復(fù)1次；上清液加2/3體積冷異戊醇(-20℃)混勻置-20℃冰箱30min。于4℃、10 000r/min離心20min，吸取上清液采用70%乙醇沉淀2次，洗去乙醇，倒置試管于吸水紙上，于無(wú)菌臺(tái)吹風(fēng)機(jī)吹干，加入ET洗液300～400μL,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 DNA檢測(cè)

檢測(cè)已提取的植物總DNA，采用瓊脂糖電泳方法：置于1%的瓊脂凝膠，加示蹤劑(溴酚藍(lán)和二甲基苯青)電泳30min，完畢，凝膠成像儀中觀察。

2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

反應(yīng)總體積為 30μL，成分：2×TBE緩沖液15μL，牛血清蛋白(BSA)1.5μL，2個(gè)引物各2μL,ddH2O 9.5μL，模板DNA(植物基因DNA)2μL。程序：94℃變性，36℃退火35s，72℃延伸70s，2個(gè)循環(huán)，94℃變性，36℃退火35s，72℃延伸70s，42個(gè)循環(huán)共44個(gè)循環(huán)[1]；94℃預(yù)變性，180s；94℃，60s；39℃，45s；72℃，60s；35個(gè)循環(huán)最后72℃，180s。

取上述反應(yīng)液10μL檢測(cè)，置1.6%的瓊脂糖凝膠上，加示蹤染料，采用10×TBE的電極緩沖液30min，完畢，在凝膠成像儀中成像。

2.3 無(wú)產(chǎn)物出現(xiàn)原因

循環(huán)溫度、解鏈溫度不夠確切，或者PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度不符；引物組成不合理；聚合酶活性發(fā)生異常；植物來(lái)源DNA較難去除多糖、多酶等物質(zhì)，可能抑制PCR反應(yīng)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所用維藥均為維吾爾醫(yī)院所提供的干品藥材，大都能提取總DNA，說(shuō)明PCR技術(shù)具有應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)；對(duì)提取出來(lái)的二十三味藥進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，無(wú)擴(kuò)增譜帶出現(xiàn)，可看見(jiàn)引物聚合點(diǎn)。提示PCR技術(shù)在種類(lèi)與質(zhì)量方面的研究，可為維藥提供更快、更簡(jiǎn)捷、更有效的鑒定方法[6]。

本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備較為充分，但是由于受實(shí)驗(yàn)條件的限制，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想。藥材總DNA提取較好，但在DNA片段擴(kuò)增時(shí)，引物的選用尚處于初步摸索階段，同時(shí)由于時(shí)間有限，致使最終的結(jié)果并不理想。多次實(shí)驗(yàn)僅能看到引物聚合點(diǎn)，而無(wú)擴(kuò)增片段出現(xiàn)。因此，實(shí)驗(yàn)方法、引物的選用及擴(kuò)增程序還需進(jìn)一步摸索與改進(jìn)。

[1] 王培訓(xùn),周聯(lián),賴(lài)小平.分子生物學(xué)技術(shù)與中藥鑒[M].廣州：廣東世界圖書(shū)出版公司,2002： 92-112.

[2] 劉勇民,沙吾提·伊克木.維吾爾藥志[M].烏魯木齊：新疆人民出版社,1985.

[3] 肖樹(shù)雄,林偉忠.中藥現(xiàn)代檢驗(yàn)新技術(shù)[M].廣州：羊城晚報(bào)出版社，2003：137-183.

[4] 中藥大辭典編寫(xiě)組.中藥大辭典(上、下冊(cè))[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1975.

[5] 吳平,周亞平.用聚合酶鏈產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)鑒定中藥鱉甲[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 1982,29(1)：17-21.

[6] 徐朝暉,涂為,楊松松.RAPDF法結(jié)合TLC鑒別中藥牛蒡子及其混淆品[J].中草藥,2000，3(6)：45-46.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

2014-04-29

靳劍(1982-)，男，烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部藥師，研究方向?yàn)榫S藥現(xiàn)代化研究。

R291.5

A

1673-2197(2014)16-0014-02