王存文，孟 陽，汪鐵林，呂仁亮＊，王成成，張艷芳

［1．武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2．綠色化工過程教育部重點實驗室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢 430074］

0 引 言

生物柴油作為一種可再生的環(huán)保能源，在過去幾十年里引起了全世界的廣泛關(guān)注［1］．植物油、動物脂肪和微生物油脂是生產(chǎn)生物柴油的主要原料［2－3］．其中，微生物油脂的脂質(zhì)產(chǎn)量高，而且與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)相比，微生物細胞增殖快、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低、生長所需的原料來源廣泛［4］．在眾多的微生物中，微藻的油脂成分較為單一、組成與普通植物油相似，且產(chǎn)率較高（在特定培養(yǎng)條件下可達到自身干重質(zhì)量分數(shù)的85%）［5］．微藻適應(yīng)環(huán)境的能力很強，在整個生物圈均有分布，不會與農(nóng)作物爭搶良田［6］．微藻具有較高的光合效率，可以提供更有效的方法來回收營養(yǎng)物質(zhì)［7］，其代謝產(chǎn)物量比傳統(tǒng)微生物要高得多［8］．用葡萄糖異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)微藻可達到51．2 g／L的生物量［9］，而富油微藻能夠產(chǎn)生大量的單細胞油脂（SCOs），產(chǎn)量可超過其干重質(zhì)量分數(shù)的20%［10］，這些單細胞油脂的主要成分是非常適合于生產(chǎn)生物柴油的甘油三酯（TAGs）［11］．其中，蛋白核小球藻因繁殖能力強、用途廣泛而受到廣泛的關(guān)注，本研究選取蛋白核小球藻作為研究對象．

微藻在培養(yǎng)過程中通常會受到其他微生物的污染．這些微生物會對其生長速度及藻密度產(chǎn)生影響，其中細菌的影響較為顯著．可與微藻共同生存的細菌被稱為共生菌，存在競爭關(guān)系的則被稱為非共生菌［12］．非共生菌對微藻的生長是有害的，甚至有些具有溶藻性的細菌對微藻來說是致命的［13］．抑菌劑對于細菌具有良好的抑制作用，采用抑菌劑可消除非共生菌對微藻生長的影響［14］．關(guān)于抑菌劑在微藻培養(yǎng)中的應(yīng)用的報道主要集中在藻類遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇性標(biāo)記［15］．微藻在培養(yǎng)過程中通常會受到放線菌和霉菌的污染．孟加拉紅、制霉菌素和硫酸鏈霉素能夠有效抑制放線菌和霉菌的繁殖線菌［16－17］．據(jù)筆者所知，至今未見孟加拉紅對小球藻生長影響的報道．

本實驗選用孟加拉紅、制霉菌素和硫酸鏈霉素作為抑菌劑，研究其對蛋白核小球藻生長的影響，旨在尋找可抑制或消滅微藻非共生菌而對微藻本身影響較小或有促進作用的抑菌劑．

1 實驗部分

1．1 材料

孟加拉紅（生物純級）購自阿拉丁試劑，硫酸鏈霉素［Amresco 0382，Potency（dry basis）：650～850 mcg／mg］和制霉菌素［Amresc 0418，Potency（anhydrous）：4 400 u／mg］購自武漢華順生物技術(shù)有限公司．BG－11培養(yǎng)基根據(jù)文獻［18］配置，所用試劑全部為分析純級．蛋白核小球藻購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所．

1．2 微藻培養(yǎng)

培養(yǎng)溫度為25℃，將微藻置于100 m L錐形瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為BG－11培養(yǎng)基，并用強度為4 000 lx的冷白光燈對微藻進行光照，光暗周期L∶D＝12 h∶12 h．同時每天搖動培養(yǎng)瓶數(shù)次，以防止微藻下沉或附壁．在實驗組中加入抑菌劑，依文獻選取3種抑菌劑的質(zhì)量濃度分別為：孟加拉紅23 mg／L、硫酸鏈霉素30 mg／L和制霉菌素25 mg／L［19－21］．每個實驗都包括實驗組和不加抑菌劑的對照組，兩組的其它培養(yǎng)條件相同．

1．3 微藻細胞密度分析

微藻細胞密度采用紫外分光光度計（天津拓普WFZ－26A）和托馬血細胞計數(shù)器（上海求精生化試劑儀器有限公司，滬制02270113號）測定．利用紫外分光光度計測定蛋白核小球藻在680 nm處的吸光度，并用托馬血細胞計數(shù)器測得細胞數(shù)，可得到細胞數(shù)和吸光度的關(guān)系曲線［22］．經(jīng)測試，孟加拉紅、制霉菌素和硫酸鏈霉素在680 nm下均無吸收．本實驗測得蛋白核小球藻的藻密度與吸光度之間的關(guān)系如圖1所示．實驗過程中測定樣品在680 nm處的吸光度即可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到微藻的細胞密度．

圖1 微藻細胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．1 The standard curve of algal cell density

2 結(jié)果與討論

2．1 單一抑菌劑的影響

2．1．1 孟加拉紅的影響 孟加拉紅對蛋白核小球藻生長情況的影響如圖2所示．在初始24 h內(nèi)，實驗組的微藻密度略有下降，由1．229×107cells／mL減少至1．172×107cells／m L．微藻對孟加拉紅有一個適應(yīng)的過程，從而導(dǎo)致在培養(yǎng)初期藻密度會有所降低．隨著培養(yǎng)時間的增加，微藻逐漸適應(yīng)孟加拉紅，藻密度逐漸增加．培養(yǎng)96 h后，藻密度增加至1．790×107cells／m L．隨后藻密度急劇增加，培養(yǎng)時間為120 h時增加至2．264×107cells／mL，到168 h，達到4．216×107cells／m L，而不經(jīng)處理的對照組小球藻細胞密度僅為3．325×107cells／mL．這是因為低濃度的活性氧可激活蛋白酶，調(diào)節(jié)基因表達的合成和誘導(dǎo)，導(dǎo)致細胞增殖［23－24］，可出現(xiàn)毒物興奮效應(yīng)［25］，即低含量的毒性介質(zhì)所產(chǎn)生的刺激作用促使微藻生長率顯著增加．隨著毒性介質(zhì)濃度的降低，微藻細胞的生長得到恢復(fù)和促進．結(jié)果表明，較低濃度的孟加拉紅能夠明顯促進蛋白核小球藻的生長，提高藻密度．

圖2 加入孟加拉紅后小球藻的生長曲線Fig．2 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa after exposure to Rose Bengal

2．1．2 制霉菌素的影響 如圖3所示，在加入了制霉菌素的實驗組中，藻密度隨著培養(yǎng)時間的增長而降低，從1．192×107cells／mL下降至5．23×106cells／m L．微藻的顏色也從綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色．一定濃度的制霉菌素對蛋白核小球藻具有毒害作用，會導(dǎo)致大量藻細胞死亡，從而導(dǎo)致藻密度降低、藻細胞顏色改變，抑制蛋白核小球藻的生長［26］．雖沒有直接的證據(jù)證明制霉菌素影響小球藻的代謝過程，但可能因為制霉菌素吸收K＋，導(dǎo)致輔因子從細胞中滲漏，最終導(dǎo)致代謝停止［27］．制霉菌素對蛋白核小球藻的生長具有非常明顯的抑制作用．

圖3 加入制霉菌素后小球藻的生長曲線Fig．3 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa after exposure to Nystatin

2．1．3 硫酸鏈霉素的影響 如圖4所示，實驗組和對照組中蛋白核小球藻的生長趨勢基本相同，但實驗組的藻密度始終高于對照組，藻密度的最大值分別為3．512×107cells／m L和3．325×107cells／m L．培養(yǎng)120 h后，兩組微藻都進入穩(wěn)定期，對照組的藻密度保持穩(wěn)定，而實驗組的藻密度則略有下降．144 h后兩組的藻密度趨于相等．在培養(yǎng)初期，實驗組中的蛋白核小球藻的生長速率比對照組要高得多．這主要是因為硫酸鏈霉素對微藻生長產(chǎn)生促進作用，在微藻進入穩(wěn)定生長期后，硫酸鏈霉素的濃度降低，促進生長的作用減弱．

圖4 加入硫酸鏈霉素后小球藻的生長曲線Fig．4 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa after exposure to Streptomycin Sulphate

2．2 混合抑菌劑的影響

單一抑菌劑孟加拉紅和硫酸鏈霉素均對微藻生長具有一定的促進作用，但在蛋白核小球藻的不同培養(yǎng)階段產(chǎn)生的效果不同．本實驗將這兩種抑菌劑配合使用，研究了混合抑菌劑對蛋白核小球藻生長的影響．抑菌劑采用以下3種方式加入：A．實驗初期同時加入兩種抑菌劑；B．實驗初期加入孟加拉紅，96 h后加入硫酸鏈霉素；C．實驗初期加入硫酸鏈霉素，96 h后加入孟加拉紅．

如圖5所示，按3種方式加入抑菌劑后，小球藻的生長均受到程度不一的抑制，嚴重的甚至導(dǎo)致死亡．可見混合抑菌劑比單一抑菌劑對蛋白核小球藻的毒性作用更大，且由于抑菌劑擁有各自的抗菌譜圖，當(dāng)將抑菌劑進行混合后，它們對微藻的影響也更為復(fù)雜［19，21，28］．藻的細胞膜可能會被破壞，最終導(dǎo)致代謝停止．

2．3 抑菌劑對脂質(zhì)含量的影響

本實驗利用超臨界CO2萃取法和索氏提取法對實驗組（在培養(yǎng)基中加入單一的孟加拉紅或硫酸鏈霉素）和對照組的微藻進行脂質(zhì)含量測定．超臨界CO2萃取法的實驗條件為：萃取溫度45℃，壓力30 MPa，萃取時間120 min［29］；索氏提取法采用無水乙醚作為提取劑，每小時虹吸6次，持續(xù)12 h，提取劑提取藻粉時已經(jīng)無色可視為提取完全［30］．

圖5 不同的抑菌劑混合方式對微藻生長的影響Fig．5 The effect of mixed antibiotics on microalgae

表1列出了經(jīng)超臨界CO2萃取法和索氏提取法得出的微藻油脂含量，油脂含量用藻細胞干重的百分數(shù)表示．由表1可知，無論是否經(jīng)孟加拉紅或硫酸鏈霉素處理，微藻的脂質(zhì)含量幾乎沒有受到影響．與對照組相比，在加入孟加拉紅和硫酸鏈霉素后，雖然小球藻的脂質(zhì)含量都略有下降但變化不大，對這兩種油脂提取方法而言，孟加拉紅實驗組相對于對照組的油脂含量均下降了0．5%，下降幅度分別為2．12%和2．18%；硫酸鏈霉素實驗組相對于對照組的油脂含量分別下降了0．1%和0．8%，下降幅度分別為0．42%和3．49%．

表1 微藻細胞內(nèi)油脂含量Table 1 The lipid content of microalgae

3 結(jié) 語

本實驗研究了孟加拉紅，制霉菌素和硫酸鏈霉素對蛋白核小球藻生長情況的影響，并利用超臨界CO2萃取法和索氏提取法從微藻中提取了油脂．結(jié)果表明，單獨加入孟加拉紅或硫酸鏈霉素對蛋白核小球藻的脂質(zhì)含量幾乎沒有影響，其藻密度的最大值分別可達到4．216×107cells／m L、3．512×107cells／m L，高于對照組的 3．325×107cells／m L．制霉菌素會抑制蛋白核小球藻的生長，孟加拉紅和硫酸鏈霉素可以促進微藻的生長，但孟加拉紅和硫酸鏈霉素的混合物對微藻生長有抑制作用．

致謝

感謝綠色化工過程教育部重點實驗室及武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院提供的實驗平臺！

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