羅少華，熊 澤，邵 偉，郭 軍

（三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北宜昌 443001）

己酸乙酯作為濃香型白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)，是衡量白酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1]，市場需求量很大。目前主要利用酸催化法[2]制備；但化學(xué)法制備的產(chǎn)品質(zhì)量不高，同時酸催化還會產(chǎn)生大量廢液，造成環(huán)境污染。相比之下，脂肪酶催化合成己酸乙酯反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品風(fēng)味柔和、香醇自然，具有重要的研究意義和應(yīng)用價值[3-5]。

在研究有機介質(zhì)中脂肪酶催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的轉(zhuǎn)化率[6-8]時，多采用中和滴定法。在對比研究各種因素對轉(zhuǎn)化率的影響時，滴定法操作簡便，盡管使用濃度極低的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定，但是由于己酸為弱酸，分析樣品中己酸含量很少且相差不明顯，導(dǎo)致滴定分析數(shù)據(jù)穩(wěn)定性不好。張艷等[9-10]用氣相色譜法測定了己酸乙酯的含量，本研究以實驗室現(xiàn)有儀器為基礎(chǔ)，以乙酸正戊酯為內(nèi)標(biāo)物，參考文獻[11-14]的氣相色譜條件，擬建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的測定脂肪酶催化反應(yīng)體系中己酸乙酯含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷（分析純）、乙酸正戊酯（色譜純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）、己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；正己酸（分析純）：濟南興隆化工有限公司；脂肪酶（Novozym 435）：丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-7890F氣相色譜儀：上海天美科學(xué)儀器有限公司；SGD-300氮、氫、空發(fā)生器：北京東方精華苑科技有限公司；BSA224S-CW電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DKZ-2電熱恒溫振蕩水槽：上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜條件

色譜條件：色譜柱（AT.PEG-20M 30m×0.25mm×0.33μm）：中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，T2000P色譜工作站。程序升溫：起始柱溫55℃，恒溫1min，以10℃/min升溫至70℃，恒溫2min，再以20℃/min升溫至180℃，保持5min；進樣口溫度200℃；采用氫焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）、溫度220℃進行測定；分流比：不分流；進樣量：1μL。

1.3.2 樣品溶液制備

在50mL碘量瓶中加入20mL正己烷和一定量的己酸和乙醇，混合均勻，再加入適量的脂肪酶Novozym435，在45℃恒溫水浴中振蕩反應(yīng)10h；靜置，上清液為樣品溶液。

1.3.3 溶液的配制

量取0.2mL乙酸正戊酯，置于10mL容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的內(nèi)標(biāo)溶液。

量取0.2mL己酸乙酯，置于10mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液。

量取標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液5.00mL和內(nèi)標(biāo)溶液3.00mL，置于10mL容量瓶中，正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.4 色譜分離鑒定

分別取不含己酸乙酯和內(nèi)標(biāo)物的陰性對照溶液（正己烷溶劑）、內(nèi)標(biāo)溶液、標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液、樣品溶液及加標(biāo)樣品溶液，在1.3.1的色譜條件下，1μL進樣，以便進行色譜鑒別。

1.3.5 校正因子f的測定

取含標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在1.3.1的色譜條件下，1μL進樣，測定己酸乙酯和乙酸正戊酯峰面積積分值，并計算積分值的比值和相對校正因子f；連續(xù)6次進樣，考察相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.6 最低檢測限的測定

量取1.30mL、1.40mL、1.50mL、1.60mL、1.70mL、1.80mL標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，置于6個10mL的容量瓶中，在6個容量瓶中精密加入內(nèi)標(biāo)溶液各3.00mL，加正己烷稀釋至刻度，搖勻。在1.3.1的色譜條件下分別進樣1μL，觀察各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品岀峰情況，檢測最小響應(yīng)值，確定最低檢測限。

1.3.7 樣品中己酸乙酯含量的測定和精密度評價

量取試樣1.00mL，移入2%的內(nèi)標(biāo)溶液3.00mL，加入正己烷稀釋至10mL。混勻后，按校正因子測定相同的條件操作，根據(jù)保留時間確定己酸乙酯峰的位置，根據(jù)己酸乙酯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比，按內(nèi)標(biāo)法計算出樣品中己酸乙酯的含量。連續(xù)取樣6次，取平均值，考察RSD值。

1.3.8 加標(biāo)回收率實驗

量取1.00mL樣品溶液3份，置于3個10mL容量瓶中；按己酸乙酯最低檢測限含量的1.0、1.1、1.2倍量，量取己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，分別轉(zhuǎn)移到容量瓶中；再加入內(nèi)標(biāo)溶液各3.00mL，用正己烷定容、搖勻。在1.3.1的色譜條件下取1μL進樣，測定并記錄己酸乙酯和內(nèi)標(biāo)峰面積，按內(nèi)標(biāo)法計算出樣品中己酸乙酯的含量和平均回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離鑒定

色譜分離實驗結(jié)果見圖1～圖6。

圖1 陰性對照溶液的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of negative control solution

圖2 內(nèi)標(biāo)物溶液的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of internal standard solution

圖3 標(biāo)準(zhǔn)對照品的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of standard reference material

圖4 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of standard stock solution

圖5 樣品溶液的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of sample solution

圖6 加入內(nèi)標(biāo)物的樣品溶液的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of sample with internal standard substance

圖1顯示溶劑正己烷的流出峰，說明陰性對照溶液無干擾；圖2顯示內(nèi)標(biāo)物乙酸正戊酯的相對保留時間為3.056min；圖3顯示標(biāo)準(zhǔn)品己酸乙酯的相對保留時間為4.482min；圖4顯示混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液極好重現(xiàn)了乙酸正戊酯和己酸乙酯的相對保留時間分別為3.058min和4.486min；且乙酸正戊酯、己酸乙酯之間分離度大于2；圖5為樣品溶液的色譜圖；圖6是加入內(nèi)標(biāo)物的樣品溶液的色譜圖，圖5、圖6對比顯示樣品中含有待測定的己酸乙酯，不存在內(nèi)標(biāo)物，說明本研究選擇的內(nèi)標(biāo)物合適。

2.2 校正因子f的測定

校正因子f的測定結(jié)果，見表1。

表1 校正因子實驗測定結(jié)果（n=6）Table 1 Results of calibration factor test

計算相對校正因子的平均值為0.983 7，測定相對校正因子的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.59%。相對校正因子是己酸乙酯與內(nèi)標(biāo)物乙酸正戊酯的質(zhì)量相等時，內(nèi)標(biāo)物的峰面積是己酸乙酯組分峰面積的倍數(shù)，由于己酸乙酯與內(nèi)標(biāo)物是同系物，理化性質(zhì)相近，與實驗測定的校正因子值0.983 7相符。相對校正因子f值只與被測物和標(biāo)準(zhǔn)物以及檢測器的類型有關(guān)，而與操作條件無關(guān)，實驗中相對校正因子測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.59%，說明實驗中相對校正因子f值的測定穩(wěn)定性好。

2.3 最低檢測限的測定

最低檢測限的測定結(jié)果見表2。

表2 最低檢測限測定結(jié)果Table 2 Result of the lowest detectable limit determination

表2實驗結(jié)果表明，色譜峰最低響應(yīng)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品進樣量為2.774μg/mL，因此，本法分析己酸乙酯的最低檢測限接近2.774μg/mL。

2.4 樣品中己酸乙酯含量的測定和精密度實驗

樣品中己酸乙酯含量測定及精密度實驗結(jié)果見表3。

表3 樣品己酸乙酯含量的測定Table 3 Determination of ethyl hexanoate in sample

根據(jù)樣品測定的己酸乙酯峰與乙酸正戊酯的峰面積、添加內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度和己酸乙酯的相對校正因子，參考國家標(biāo)準(zhǔn)[15]，計算樣品中己酸乙酯含量。分析樣品中己酸乙酯平均含量為71.373 4mg/mL，精密度RSD=0.97%。重復(fù)6次取樣分析，樣品中己酸乙酯含量的RSD=0.97%，說明分析操作的精密度好，穩(wěn)定性高。

2.5 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果與分析

表4 己酸乙酯加標(biāo)回收率Table 4 Standard addition recovery of ethyl hexanoate

按己酸乙酯最低檢測限含量的1.0、1.1、1.2倍量添加標(biāo)準(zhǔn)己酸乙酯對照品，樣品加標(biāo)回收率見表4。平均加標(biāo)回收率為97.44%，說明本法測定脂肪酶催化反應(yīng)體系中己酸乙酯含量準(zhǔn)確可行。

3 結(jié)論

在正己烷等有機溶劑中，固定化脂肪酶催化己酸和乙醇合成己酸乙酯轉(zhuǎn)化率高，是一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的途徑。研究催化反應(yīng)體系有機溶劑的選擇、固定化酶的用量、底物己酸和乙醇的濃度和組成、反應(yīng)溫度及時間等因素對酯化過程的影響，優(yōu)化己酸乙酯的合成工藝，需要快速、準(zhǔn)確、靈敏地測定己酸乙酯含量。建立的毛細(xì)管氣相色譜法測定脂肪酶催化反應(yīng)體系中己酸乙酯含量，操作簡便快速、省時、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，己酸乙酯的最低檢測限為2.774μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.97%，平均加標(biāo)回收率為97.44%。毛細(xì)管氣相色譜法測定脂肪酶催化反應(yīng)體系中己酸乙酯含量可更有效地研究酶法合成己酸乙酯相關(guān)課題，也可在該法的工業(yè)化生產(chǎn)中，為己酸乙酯半成品和成品質(zhì)量分析提供借鑒。

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