張旭，王艷偉，楊光參

(溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院，浙江 溫州 325035)

DNA凝聚是將一根或幾根自由伸長(zhǎng)的DNA凝聚成緊湊、有規(guī)律形態(tài)的過程，是基因治療的重要組成部分［1］。因聚合物的尺寸及分散性對(duì)基因治療效果有很大的影響，所以凝聚劑的選擇尤為重要［2－4］。殼聚糖是一種天然的高分子，具有優(yōu)良的生物相容性、生物可降解性、低毒以及高正電荷的性質(zhì)，所帶的陽離子可以與DNA上的陰離子有效結(jié)合，并且保護(hù)其免受核酸酶的降解，以保障DNA所受的破壞最小，同時(shí)裝載DNA的殼聚糖微粒性質(zhì)比較穩(wěn)定［1，5－13］。這些特點(diǎn)使得殼聚糖被廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)的很多領(lǐng)域中，如制藥、組織工程和基因傳遞等［11－15］。

目前對(duì)殼聚糖的研究很多，Stranad等［16］通過實(shí)驗(yàn)證明了殼聚糖凝聚DNA的能力與乙?；瘑挝缓考熬酆隙染o密相關(guān)，即環(huán)狀與棒狀聚合物的比，隨著乙?；瘑挝缓康脑黾佣档?，同時(shí)證明了殼聚糖的電荷密度是決定聚合物形態(tài)的重要因素。Liu等［17］排除乙?；鶎?duì)殼聚糖與DNA相互作用的影響，用CD光譜、靜電熒光和原子力顯微鏡(AFM)等方法研究在不同殼聚糖與DNA電荷比k下，殼聚糖－DNA聚合物的形態(tài)學(xué)特征，并驗(yàn)證了其穩(wěn)定性與pH值緊密相關(guān)。Cao等［18］進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論，即pH值為5時(shí)聚合物是穩(wěn)定存在的，當(dāng)pH值上升到9時(shí)，凝聚態(tài)的DNA被釋放出來。Strand等［16］也通過研究證實(shí)了殼聚糖的電荷密度及每條鏈上的電荷數(shù)是聚合物形態(tài)的決定因素，同時(shí)也驗(yàn)證了當(dāng)pH值大于7.4時(shí)聚合物的穩(wěn)定度下降，這就為基因治療中生理pH值附近的聚合物穩(wěn)定度降低提供了理論依據(jù)。

單分子磁鑷(magnetic tweezers，MT)、AFM等技術(shù)的迅速發(fā)展使我們能夠深入地研究生物大分子的一些特性，實(shí)時(shí)觀測(cè)單分子的運(yùn)動(dòng)軌跡，通過對(duì)這些分子機(jī)械性能的研究，使我們了解它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制。因此，單分子技術(shù)對(duì)了解DNA凝聚及分子性質(zhì)有很大的幫助。應(yīng)用問題可以在單根DNA分子上施加一個(gè)恒定的力，同時(shí)測(cè)量它的長(zhǎng)度隨時(shí)間的變化，進(jìn)而對(duì)其作用過程得以深入地了解［19－21］。本文我們采用AFM及MT技術(shù)，系統(tǒng)地研究了殼聚糖作用下的DNA凝聚。用AFM技術(shù)對(duì)聚合物形態(tài)及尺寸隨電荷比k的變化規(guī)律進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后應(yīng)用MT技術(shù)觀察凝聚力及拉伸步距隨k值的變化規(guī)律，并進(jìn)一步研究其相互作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)選用的噬菌體λ－DNA及bpr322－DNA購自New England Biolabs公司，原始濃度是500 ng/μL，使用前無需提純。純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)經(jīng)密理博超純化系統(tǒng)去離子，紫外滅菌處理。殼聚糖、MgCl2及配置殼聚糖溶液所使用的NH4AC及乙酸均購自美國Sigma公司。殼聚糖用分1%乙酸溶液稀釋至1 mg/mL作為母液，后期用150mmol/L NH4AC(pH=7.4)稀釋到不同濃度。

圖1 橫向單分子MT裝置Fig.1 Horizontal single molecule MT device

1.2 MT實(shí)驗(yàn)裝置及方法

本實(shí)驗(yàn)采用橫向單分子MT裝置(圖1A)，首先將0.17 mm厚的蓋玻片一側(cè)磨光，然后夾到兩個(gè)載玻片中間，四周用玻璃膠密封，形成一個(gè)流動(dòng)的密封槽，兩邊接兩個(gè)玻璃微管，用于導(dǎo)入及導(dǎo)出緩沖液與藥品等。樣品槽放到倒置顯微鏡的40倍物鏡上面觀察，用三維操縱儀控制順磁鐵對(duì)焦平面上的DNA施加力。事先磨光的蓋玻片的側(cè)壁涂有抗地高辛與DNA一端的地高辛連接。當(dāng)DNA與磁球的混合液沖入樣品槽后，就會(huì)形成側(cè)壁－DNA－順磁球的結(jié)構(gòu)(圖1B)。導(dǎo)入試劑的樣品槽在室溫下垂直靜止放置半小時(shí)，放置過程中應(yīng)確保磨光的蓋玻片表面向上，確保DNA分子連接到磨光的側(cè)壁上。然后用緩沖液沖洗，去除多余的未連接在側(cè)壁上的DNA分子，確保實(shí)驗(yàn)過程視野清晰。用顯微鏡找到連接好的DNA分子，觀察并錄像。通過測(cè)量磁球與蓋玻片側(cè)壁之間的距離得到DNA的長(zhǎng)度，通過磁球在垂直于DNA伸長(zhǎng)方向上的布朗運(yùn)動(dòng)得到DNA所受的拉力［20，22－23］。其磁力可表示為。

其中KB為玻爾茲曼常量，T為熱力學(xué)溫度，δx為磁球布朗運(yùn)動(dòng)x方向的均方差。

通過分析軟件分析力與長(zhǎng)度的關(guān)系，對(duì)比已知數(shù)據(jù)來確定是否為單根DNA。根據(jù)不同的k值計(jì)算出殼聚糖濃度，用1 mg/mL的殼聚糖作為母液，并用150mmol/L NH4AC(pH=7.4)稀釋到所需要的濃度并注入到樣品槽里面，培養(yǎng)15 min后，觀察不同k值下DNA的長(zhǎng)度隨時(shí)間的變化關(guān)系。

1.3 AFM實(shí)驗(yàn)裝置及方法

實(shí)驗(yàn)裝置為日本京都島津公司生產(chǎn)的AFM，型號(hào)為SPM－9600。AFM在空氣中掃描圖像采用輕敲模式獲得。掃描速度為3 Hz，均方振幅是2 V，驅(qū)動(dòng)頻率約350 kHz，硅探針具有42 N/m的固定彈性系數(shù)，圖片像素512×512。首先按不同的k值計(jì)算出100 μL溶液所需的DNA的量(實(shí)驗(yàn)中所使用的DNA的濃度均為原始濃度)。取出DNA后放入離心管中，按計(jì)算所得加入殼聚糖溶液后，用NH4AC溶液稀釋，最終保證DNA的濃度恒定為4 ng/μL備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用移液器取出15 μL的DNA－殼聚糖混合液滴到新鮮剝離的云母片表面上，靜置2～3 min，然后用20 μL的Milli－Q超純水沖洗云母片，大約沖洗10～15次，最后用氮?dú)獯蹈蓸悠?，將樣品在干燥器中保? h以上待用。

2 結(jié)果與討論

應(yīng)用MT技術(shù)研究不同k值下DNA在殼聚糖作用下的凝聚過程及凝聚力的變化，并得出其變化的規(guī)律。應(yīng)用AFM技術(shù)觀察不同種類的DNA在相同k值下聚合物的形態(tài)學(xué)上的區(qū)別，同時(shí)觀察同種DNA在不同k值下的形態(tài)學(xué)的變化規(guī)律并與MT結(jié)果相對(duì)照，進(jìn)而深入地了解DNA在殼聚糖作用下的凝聚過程。

2.1 用MT研究λ－DNA的力譜變化

殼聚糖是目前常用的基因治療的載體，我們利用MT技術(shù)研究不同濃度的殼聚糖作用下的λ－DNA的力譜曲線變化。在恒定外力作用下，沒有加入任何藥品時(shí)λ－DNA的長(zhǎng)度是不隨時(shí)間變化的，即DNA的長(zhǎng)度在恒力作用下保持不變，只有本身布朗運(yùn)動(dòng)引起的微小長(zhǎng)度變化。而在溶液中加入k=2的相應(yīng)濃度的殼聚糖后，我們會(huì)觀測(cè)到λ－DNA的凝聚過程。因凝聚過程中控制外力難以恒定，而拉伸過程中可有效地克服此缺點(diǎn)，所以我們選取拉伸曲線為研究對(duì)象?？刂仆饬?.9 pN，觀測(cè)λ－DNA的拉伸過程(圖2)，從側(cè)面證明了在殼聚糖的作用下DNA發(fā)生了折疊及凝聚。另外，殼聚糖濃度較小且施加在DNA上的外力很大時(shí)，也會(huì)發(fā)現(xiàn)λ－DNA的長(zhǎng)度有所收縮，證明殼聚糖對(duì)λ－DNA的作用比較強(qiáng)。

圖2 k=2時(shí)，加入殼聚糖后DNA的長(zhǎng)度與時(shí)間關(guān)系曲線Fig.2 Extension－time curve ofthe DNA corresponding to k=2 after chitosan adding

圖3 k=4時(shí)，加入殼聚糖后DNA的長(zhǎng)度與時(shí)間關(guān)系曲線Fig.3 Extension－time curve ofthe DNA corresponding to k=4 after chitosan adding

圖3給出了k=4時(shí)殼聚糖－DNA聚合物在5.9 pN的恒力作用下的拉伸曲線，與圖2比較可知，當(dāng)k值增大時(shí)拉伸曲線中大跳躍步距明顯增多，且初始階段的長(zhǎng)度變化趨勢(shì)明顯加快。這可能是因?yàn)殡S著k值的增加，DNA凝聚得更加緊湊且凝聚的節(jié)點(diǎn)增多，因而被拉伸的機(jī)會(huì)也相應(yīng)地增加。而當(dāng)k=2或k=4時(shí)均發(fā)現(xiàn)有500 nm左右的大步距存在，這可能是因?yàn)镈NA在凝聚過程中形成的幾個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)同時(shí)被打開造成的。

2.2 用AFM研究殼聚糖與不同類型DNA的作用

配制不同濃度的殼聚糖溶液，按不同的k值與環(huán)狀pbr322－DNA混合，制成AFM樣品進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)聚合物的形態(tài)隨著k值的變化而明顯變化，圖4是不同k值下，殼聚糖與環(huán)狀pbr322－DNA分子相互作用的AFM圖像。圖4A為沒有加入任何藥品的環(huán)狀pbr322－DNA分子的AFM圖像，當(dāng)沒有與藥物分子相互作用時(shí)，DNA成圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)。圖4B～D分別對(duì)應(yīng)k值為2、5、6時(shí)，加入殼聚糖后的DNA圖像，從中可發(fā)現(xiàn)DNA發(fā)生凝聚，而且有環(huán)狀、棒狀及球狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。當(dāng)k值不斷增加時(shí)，球狀和棒狀結(jié)構(gòu)的比值不斷減小，且凝聚物的尺寸也逐漸變小。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知在k值由2增加到6時(shí)，球狀與棒狀聚合物的比由2減小到0.75。此部分結(jié)果與前人實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果基本一致［24］。

圖4 環(huán)狀pbr322－DNA分子的AFM圖像及不同k值下的殼聚糖與環(huán)狀pbr322－DNA分子相互作用的AFM圖像。Fig.4 AFM imageofcirclepbr322－DNA molecules and AFM images of the interaction between circle pbr322－DNA and chitosan

圖5 線狀λ－DNA分子以及不同k值下的殼聚糖與線狀λ－DNA分子相互作用的AFM圖像Fig.5 AFM image of linear λ－DNA molecules and AFM images of the interaction between linear λ－DNA and chitosan

為了深入地研究DNA與殼聚糖的相互作用的過程，我們變換DNA的種類，研究殼聚糖與線狀λ－DNA分子的相互作用。圖5 A是裸λ－DNA的AFM圖像，DNA處于自由伸展?fàn)顟B(tài)。向λ－DNA溶液里面加入殼聚糖，當(dāng)k值=0.5時(shí)，線狀λ－DNA分子明顯聚集并出現(xiàn)凝聚的棒狀及球狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)k值繼續(xù)增大時(shí)，λ－DNA聚集得更加緊湊，旁邊的松散結(jié)構(gòu)全部消失并出現(xiàn)了環(huán)狀聚合物，在k值增大的過程中聚合物的尺寸也在逐漸地減小(如圖5 B ～D k值分別為0.5、2、4。).

通過比較圖6與圖7，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同DNA凝聚物的球狀與棒狀結(jié)構(gòu)比隨k值的變化規(guī)律基本是相同的，即都是隨著k值的增加而降低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)相同的k值下，使用pbr322－DNA比使用λ－phage DNA形成的粒子分散性好，且形成的粒子的尺寸基本相同。在MT實(shí)驗(yàn)中我們選用線性λ－phage DNA代替pbr322進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以便于實(shí)時(shí)地觀測(cè)殼聚糖與DNA的作用過程，對(duì)其相互作用有較為深入地了解。

圖6 pbr322－DNA－殼聚糖聚合物的球狀/棒狀比值隨著k值變化的統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Illustration of the variety of torod/rad ratio of pbr322－DNA－chitosan polymer with k

圖7 λ－phage DNA－殼聚糖聚合物的球狀/棒狀比值隨著k值變化的統(tǒng)計(jì)圖Fig.7 Illustration of the variety of spherical/rad ratio of λphage DNA－chitosan polymer with k

3 殼聚糖與DNA作用的模型簡(jiǎn)圖

圖8將DNA在殼聚糖作用下所形成聚合物的形態(tài)以直觀的方式表示出來，即DNA在殼聚糖的作用下所形成的聚合物的形態(tài)主要以環(huán)狀、棒狀和球狀為主，同時(shí)也會(huì)有一些不規(guī)則形態(tài)的聚合物存在。而且隨著k值的不同，各形態(tài)粒子之間的比例明顯的不同。原因可能是殼聚糖通過與DNA的堿基對(duì)結(jié)合，使DNA折疊和凝聚。

圖8 DNA與殼聚糖作用的模型圖Fig.8 Model image of the interaction between λ－DNA and chitosan

4 結(jié)論

本文應(yīng)用AFM及MT技術(shù)研究了殼聚糖與不同種類的DNA的相互作用過程，并對(duì)電荷比k取不同值時(shí)，DNA的凝聚過程及所形成聚合物的形態(tài)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。DNA與殼聚糖相互作用所形成聚合物的形態(tài)由初始時(shí)的不規(guī)則塊狀慢慢凝聚成具有規(guī)則形態(tài)的聚合物，其中包括球狀、環(huán)狀及棒狀，且由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，球狀或環(huán)狀與棒狀聚合物的數(shù)量之比隨著k值的增加而不斷地降低。同時(shí)，聚合物的尺寸也隨著k值的增加逐漸地減小。通過MT實(shí)驗(yàn)可知，隨著k值的不斷增加，DNA的凝聚過程所需的時(shí)間越來越短，即長(zhǎng)度隨時(shí)間的變化越來越明顯。

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