扈進(jìn)冬，吳遠(yuǎn)征，李紀(jì)順，魏艷麗，陳泉，楊合同，2

(1.山東省科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東 濟(jì)南 250014;2.山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)引起的一種在世界范圍內(nèi)影響葡萄種植的重要病害，嚴(yán)重危害葡萄的葉片和嫩梢，影響葡萄生長和產(chǎn)量。目前防治霜霉病所用藥劑大都是人工合成化學(xué)農(nóng)藥，如安泰生可濕性粉劑、甲霜靈錳鋅、霜疫必克、瑞毒霉、霜霉威和烯酰嗎啉等等。生物防治可以利用有益微生物和其代謝產(chǎn)物對植物病害進(jìn)行有效的防治，近些年來，在國家的大力支持和鼓勵下，已有多種生防菌劑在國內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。［1－3］

拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2是山東省科學(xué)院生物研究所新近從發(fā)生黃瓜霜霉病的蔬菜大棚中篩選的一株生防菌，對多種病原真菌均具有良好的拮抗作用，是一株廣譜拮抗菌，經(jīng)鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，對其抗菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化，分析為多肽類抗菌物質(zhì)。此外，該菌株還胞外分泌β-1，3-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶和蛋白酶等胞壁降解酶，通過葉盤漂浮法的室內(nèi)測定發(fā)現(xiàn)其對葡萄霜霉病菌有較好的防治效果。本文通過田間試驗初步研究了拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2在大田環(huán)境下對葡萄霜霉病的防治效果，為進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2、LTR-2為本實驗室保存木霉生防菌株，對多種真菌病害均有良好的防治效果;受試葡萄品種為“玫瑰香”。拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2保存采用改良的NA培養(yǎng)基:牛肉膏4.0 g/L，蛋白胨11.0 g/L，氯化鈉0.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH值為7.0。拮抗性多粘類芽孢桿菌發(fā)酵液:豆餅粉5%，玉米粉2%，碳酸鈣0.1%，硫酸鎂0.05%，硫酸銨0.2%，pH值為7.0。LTR-2發(fā)酵選用PDA培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 PB-2及其無菌濾液對葡萄霜霉病菌抑制作用

因葡萄霜霉病菌只能活體培養(yǎng)，故采用葉盤漂浮法［4－5］測定PB-2對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)抑制活性。試驗設(shè)6個處理:PB-2改良的NA發(fā)酵液(30℃，120 r/min培養(yǎng)36 h，菌體含量2.3×109cfu/mL)無菌水稀釋成菌體含量106、107、108cfu/mL，過0.22 μm濾膜的PB-2發(fā)酵液，72%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑(江蘇寶靈化工股份有限公司)600倍稀釋液，無菌水對照。從山東省科學(xué)院東區(qū)葡萄試驗田采集發(fā)病葉片和新梢第4～6輪未發(fā)病葉片(感病品種“玫瑰香”)。用無菌水洗下發(fā)病葉片的病菌孢子囊，配成霜霉病孢子懸浮液(孢子囊濃度控制為106cfu/mL)，4℃下存放備用。準(zhǔn)備培養(yǎng)皿若干，內(nèi)置不同處理溶液潤濕的濾紙，用打孔器在未發(fā)病葉片的葉脈間打孔制成直徑1 cm的葉盤，分別置于這些含有不同藥液處理的5 cm培養(yǎng)皿中，每處理重復(fù)3次，每皿加3片葉盤，葉背面朝上分別擺放于藥液潤濕的吸水紙上，將配制好的孢子囊懸浮液10 μL接種于葉盤中央。置于人工氣候室中，22℃下培養(yǎng)，7 d后觀察結(jié)果。根據(jù)病斑面積占葉盤面積的百分比劃分病級，0級:無病斑;1級:1% ～20%;2級:21% ～50%;3級:＞50%。計算病情指數(shù)和抑制率。

1.2.2 PB-2 的田間藥效試驗

首先制備PB-2可濕性粉劑，先將PB-2改良的NA發(fā)酵液(菌體含量2.3×109cfu/mL)與填料麥飯石(200目)按比例吸附混合至活菌體數(shù)109cfu/g，添入黃原膠(0.5%)、十二烷基磺酸鈉(0.25%)和羧甲基纖維素(5%)混合均勻，自然晾干制得拮抗性多粘類芽胞桿菌PB-2可濕性粉劑。LTR-2(木霉)可濕性粉劑(中試產(chǎn)品，含2×108cfu/g木霉活孢子)

試驗地點選在山東省科學(xué)院東區(qū)葡萄試驗田內(nèi)進(jìn)行，品種為“玫瑰香”(感病品種)，常規(guī)栽培措施管理。試驗按農(nóng)業(yè)部藥檢所田間試驗準(zhǔn)則設(shè)計［6－7］。共7個處理:PB-2可濕性粉劑用清水稀釋50、100、200倍，LTR-2(木霉)可濕性粉劑用清水稀釋50、100、200倍，清水對照。采用噴霧法施藥，在16:00后進(jìn)行，避開高溫時間。每處理3株，重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。重點噴施葉背，均勻噴施，以少量滴水為度。分別于施藥后1周、2周2次隨機(jī)選取每處理上、中、下部位100片葉調(diào)查病葉率、病情指數(shù)和相對防治效果。病情分級標(biāo)準(zhǔn)和病情指數(shù)計算方法按照國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項“果樹霜霉病防控技術(shù)研究與示范”進(jìn)行，葡萄霜霉病在葉片上的分級標(biāo)準(zhǔn):0級:無病斑;1級:病斑面積占整個葉面積的5%以下;3級:病斑面積占整個葉面積的6% ～25%;5級:病斑面積占整個葉面積的26% ～50%;7級:病斑面積占整個葉面積的51% ～75%;9級:病斑面積占整個葉面積的75%以上。病情指數(shù)=［∑(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)］×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB-2發(fā)酵液對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)抑制活性

從表1中可看出，菌含量為108cfu/mL的PB-2發(fā)酵稀釋液對葡萄霜霉病菌抑制率達(dá)到了77.22%，與對照藥劑72%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲霜靈錳鋅可濕性粉劑600倍稀釋液的抑制率(81.61%)相當(dāng)，顯著優(yōu)于其他處理;PB-2無菌濾液的抑制率(60.23%)與PB-2發(fā)酵液菌體含量107cfu/mL的抑制率(63.34%)無顯著差異;菌含量為106cfu/mL的PB-2發(fā)酵稀釋液的抑制率(53.16%)最低，顯著低于其他處理。

表1 PB-2發(fā)酵液對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)抑制活性Table 1 Indoor inhibition activity of PB-2 fermentation broth against Plasmopara uiticola

2.2 PB-2可濕性粉劑對葡萄霜霉病的田間藥效

由表2可知，PB-2可濕性粉劑的50、100倍稀釋液對葡萄霜霉病具有較好的防治效果，施藥后1周相對防效分別為46.91%和36.99%，2周后分別為46.44%和42.10%。LTR-2可濕性粉劑50倍稀釋液在1周后防效為33.81%，對葡萄霜霉病也有一定的防效，但持續(xù)性差，2周后防效不明顯，試驗未發(fā)現(xiàn)PB-2可濕性粉劑稀釋液對植株和果實有不良影響。

表2 PB-2可濕性粉劑對葡萄霜霉病的田間藥效Table 2 Field control efficacy of PB-2 wettable powder against grape downy mildew

3 討論

多粘類芽胞桿菌作為生防菌已有大量的研究報道，已發(fā)現(xiàn)其對終極腐霉菌(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)以及番茄葉霉病菌(Cladosporium fulvum)等多種病原真菌具有明顯的抑制作用。但用于葡萄霜霉病的研究還較少，田間實際應(yīng)用并有較好穩(wěn)定防效的則更是鮮有報道［8］。本試驗室篩選到的拮抗菌PB-2無論在室內(nèi)還是在田間，對葡萄霜霉病均具有較好的防效，有希望開發(fā)成為一種可有效防治葡萄霜霉病的生防制劑。目前我們已初步開發(fā)成了制劑，進(jìn)一步的田間防效試驗也正在進(jìn)行當(dāng)中，結(jié)果將在后續(xù)的文章中予以報道。

葡萄霜霉病是田間比較難防治的一種病害，PB-2可以較好防治葡萄霜霉病主要原因可能是:PB-2產(chǎn)生多肽類抗菌物質(zhì)且性質(zhì)比較穩(wěn)定，胞外分泌多種胞壁降解酶，如具有較高的β-1，3-葡聚糖酶等纖維素酶類活性［9］，而葡萄霜霉病菌作為一種低等真菌其細(xì)胞壁以纖維素為主，PB-2胞外分泌的纖維素降解酶類可以破壞其細(xì)胞壁，從而抑制其生長。實驗室生測和田間試驗結(jié)果表明，多粘類芽孢桿菌PB-2具有潛在的開發(fā)應(yīng)用前景。

［1］梅桂蘭.葡萄霜霉病的癥狀及防治措施［J］.現(xiàn)代園藝，2012(10):153.

［2］呂佩坷，龐震.中國果樹病蟲原色圖譜［M］.北京:華夏出版社，1993.

［3］史娟，楊之為.葡萄霜霉病的研究現(xiàn)狀［J］.寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2004，25(2):92－94.

［4］SCHWINN F J，SOZZI D.Recommended methods for the detection and measurement of resistance of pathogens to fungicides:Method for fungicide resistance in lateblight of potato［J］.FAO Plant Protection Bulletin，1982，30:69 － 71.

［5］陳嬌，代光輝，顧振芳，等.58種植物提取液對葡萄霜霉病菌的抑菌活性篩選研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14(5):9－13.

［6］GB/T 17980.122－2004，農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則(二)第122部分:殺菌劑防治葡萄霜霉?。跾］.

［7］李艷瓊.5種殺菌劑對葡萄霜霉病的控制效果［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，46(6):62－65.

［8］楊少波，劉訓(xùn)理.多粘類芽孢桿菌及其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報，2008，35(10):1621－1625.

［9］CHENG Y M，HSIEH F C，MENG M.Functional analysis of conserved aromatic amino acids in the discoidin domain of Paenibacillus β-1，3-glucanase［J］.Microbial Cell Factories，2009，8:62.